过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法
实验概要
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验利用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性。
实验原理
过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
R(Fe 2) H2O2==R(Fe 3 OH－)
R(Fe 3OH－)2 H2O2==R(Fe 2)2 2H2O O2
据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2
5H2O2 2KMnO4 4H2SO4 == 5O2 2KHSO4 8H2O 2MnSO4
即可求出消耗的H2O2的量。
主要试剂
1. 10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；
2. 0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；
3. 0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；
4. 0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4 •2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。
主要设备
研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。
实验材料
受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。
实验步骤
1.酶液提取 取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。
3.用0.1mol/L KMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。
4.结果计算：
酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：
酶活(mgH2O2/gFW•min)= ((A-B)*Vt*17)/(FW*V1*t)
式中 A—对照KMnO4滴定毫升数；
B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
VT—酶液总量（ml）；
V1—反应所用酶液量（ml）;
W—样品鲜重（g）；
1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。
注意事项
1. 所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。
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