目的基因的PCR克隆的原理（一）
1实验原理
1.1聚合酶链式反应（PCR）的基本构成
PCR指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、 DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq
DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq
DNA聚合酶的催化下，以dNTP
为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。
（1）模板DNA的变性
模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
（2）模板DNA与引物的退火
将反应混合物温度降低至
37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。
（3）引物的延伸
DNA模板-引物复合物在Taq
DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在
72℃条件下，Taq
DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2～4min，一次PCR经过30～40次循环，约
2～3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。
1.2 PCR反应的五个元素
参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg 2+ 。
1.2.1 引物
引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
引物设计应遵循以下原则：
（1）引物长度
长度要求在15～30bp，常用为20bp左右，引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成 Tm值过高，超过酶反应的最适温度，且合成长引物还会使费用大大增加。
（2）引物碱基构成
引物的G+C含量以40～60%为宜，因为 G+C含量过高或过低都会直接造成Tm值的过高或过低，都不利PCR反应的进行。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（3）引物二级结构
应尽量避免引物内部出现二级结构，并且两条引物间不能形成互补结构，特别是3’端的互补，否则形成引物二聚体，PCR扩增中产生非特异的条带。引物自身也应无回文对称结构（限制性酶切位点除外），防止形成茎环结构。
（4）引物3’端序列
3’端碱基要求与模板严格配对，连续配对的碱基数超过15bp，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
（5）引物中酶切位点的引入
引物中一般会引入一至两个酶切位点，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中，PCR克隆基因时已将后续方案设计完毕。
（6）引物的特异性
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性，特别是与待扩增的模板 DNA之间要没有明显的相似序列。 （7）引物量
反应体系中引物的常用浓度为0.1～1pmol/ml，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会在反应过程中形成二聚体，过低则扩增效率会降低。
1.2.2 酶及其浓度
Taq DNA多聚酶是耐热DNA 聚合酶，是从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离的。Taq
DNA聚合酶是一个单亚基，分子量为94，000 Da。具有
5’-->3的聚合酶活力，5’-->3’的外切核酸酶活力，无3’-->5’的外切核酸酶活力，会在3’末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，Taq
DNA聚合酶的出错率为10-4～10-5。此酶的发现使PCR广泛的被应用。
