反向色谱法的原理
反相色谱(RPC)是指利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离与纯化的洗脱色谱法。与HIC一样，RPC中溶质也通过疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现出强烈的疏水性。因此，必须用极性有机溶剂(如甲醇、乙腈等)或其水溶液进行溶质的洗脱分离。
溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。当固定相一定时，可以通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。RPC主要应用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可以用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性的有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活，所以，以回收生物活性蛋白质为目的时，应注意选用适宜的反相介质。
反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅胶为载体，通过表面键合非极性分子层制备。通过控制反应时间和温度，可获得性能稳定的反相介质。在硅胶基质的反相填料中，以键合有C18、C8、C2的球形多孔填料最为常见，用途最广。
RPC固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离。在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、异丙醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作为流动相。
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