基本方案6 对人类支气管移植物的转基因
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | |
| 实验步骤 | 用反转录病毒体外转导1a.用重组反转录病毒转导原初增生人类支气管细胞（基本方案 2)。转染细胞三次为最好的转导。 2a.胰蛋白酶处理原初支气管上皮细胞（一般接种后 5 山基本方案 1，第 12 步）并接种到异种移植盒（基本方案 5)。 3a.移植异种移植盒到鼠并维持异种移植物（见基本方案 5)。 4a.分化后（一般 4 周），或者用移植物做功能检测或者收获他们用来做转基因表达的组织学分析（支持方案和 CPHG13.9 单元）。一般来说，在最终的再生移植物中，原初细胞中的转导效率可维持。 用腺病毒进行体内转染1b.制备重组腺病毒，通过两个循环的 CsCl 密度梯度离心纯化，然后用葡聚糖凝胶 G50 过滤（非透析）脱盐到 HamF-12 培养基。 2b.立即滴入 100?150jul 纯化的病毒（5X10pfu 达到 10% 的转染率）到完全分化的异种移植物管腔（移植 4 周后）的一端和插入铬镍合金线塞的异种移植物关闭端 (基本方案 5)。要想达到大于 95% 的转染率，每隔一天做一次 16 h 的转染，共转染 3 次。 3b.转染异种移植物 16 h，然后用 ImlHamF-12 培养基冲洗（基本方案 5 第 3 步）。 4b.一般来说，如果要进行异种移植物气道的功能测定，有必要让异种移植物从病毒感染所引起剧烈毒力中恢复 48~72 h。 展 |
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