补体C4高压电泳及免疫固定技术
实验概要
用神经氨酸酶和羧肽酶B处理EDTA抗凝血浆，神经氨酸酶的作用主要是去涎，羧肽酶B能切除以分子p链C端的碱性氨基酸，去除副带，将经过两酶处理后的EIJE4抗凝血浆进行高压电泳，然后与抗C4血清作用形成沉淀带，将其漂洗后用考马斯亮蓝染色，参照第六届国际补体定型会议C4定型标准或C4标准血清，判断以的同种异型。
主要试剂
1. 羧肽酶B(carboxypeptidasetype I，Sigma)10mg/mL(170U/mg)。将羧肽酶B分装于若干支EP管中，每管15uL，-20℃保存，用时取出一管加l00mmol/LNaCl至80gL(可供17份样本用)。
2. 神经氨酸酶(neuraminidasetypeⅥ)IOU。将250rtl 0．2mol/L EDTA加入盛有神经氨酸酶的瓶中，-20℃保存。7.5ul EDTA抗凝血浆加2ul神经氨酸酶。
3. 抗C4血清,用时1：4或1：2稀释。
4. 透析缓冲液(pH6．8)：NaH2PO4 84．80g，Na2HPO4 66．20g，Na4-EDTA 25．00g，加蒸馏水至2L，透析时用蒸馏水1：5稀释。
5. EDTA缓冲液(pH7．2)：Na2-EDTA(MW 336．20)33．62g，Na4-EDTA(MW 380．20)38．20g，加蒸馏水至1L。
6. 电极缓冲液(pH8．8)：三羟甲基氨基甲烷(Tris)90．40g、甘氨酸112．40g、巴比妥27．40g、NaOH 2．92g加蒸馏水至4L。
7. 脱色液：甲醇900mL、冰醋酸200mL、蒸馏水900mL。
8. 染色液：考马斯亮蓝3．02，加脱色液至1L。
9. 0．75％琼脂糖：称取0．75g琼脂糖(1CN或SEAKEM．M．E)，加3mL0．2mol/L EDTA，38mL电极缓冲液，加蒸馏水至100mL，加热熔化。
实验步骤
1. 将透析液约几倒人一有盖方盘内，方盘上放一玻璃板，玻璃板上铺4层纱布，将透析膜贴在纱布上，不应有气泡。取7．5ul EDTA抗凝血浆与2ul神经氨酸酶、3ul羧肽酶B在透析膜上混合，然后利用虹吸法4℃透析过夜。
2. 将0．75％琼脂糖隔水煮沸或在微波炉中加热至琼脂糖溶液完全透明为止，立即倾注于125X260X 3mm玻璃板上，待其冷却。
3.
在凝胶板离阴极0．5cm处铺上2cm宽的4层滤纸，待滤纸完全浸湿后，轻轻揭掉；贴上塑料加样板，每孔加透析完毕的样本10uL，留二孔分别加血红蛋白和C4分型标准品，静置30min，待样本完全浸入琼脂糖凝胶中，揭掉加样板。将加样完毕的凝胶板放在冷却循环电泳槽上，样本放在阴极，打开冷却循环泵(10℃)，接通电源控制电流在65～80mA，电泳45rain或待血红蛋白迁移到离加样孔6～7cm处，停止电泳。
4.
将抗C4血清1：2或1：4稀释，均匀铺在电泳完毕的琼脂糖凝胶上，37℃30～45min，然后放人生理盐水中漂洗过夜，次日换一次生理盐水。漂洗后，用一层滤纸铺在凝胶板上，上面放2打皱纹纸用重物压住，待凝胶中水分吸干后放37℃烘干，然后放人0．3％考马斯亮蓝染色液中染色15min，再放人脱色液中脱色，直至背景清晰为上。
5. 依照第六届国际补体定型会议分型标准或将待测样本与C4分型标准血清比较，判断待测样本的同种异型。
6.
C4缺乏的判断：染色完毕的凝胶板，在激光扫描仪上进行条带密度扫描，以C4A及C4B条带密度扫描结果求取A／B比值，比值等于1g寸表示C4A、C4B可能不存在零基因，比值大于1时表示C4B可能存在一个零基因，比值小于1B寸表示C4A可能存在一个零基因。
