甲醇酵母系统表达的影响因素-3
甲醇诱导的方式、用量、诱导时间都会影响外源蛋白的表达水平。在诱导期间每天应往培养基中补加甲醇，以弥补甲醇的消耗和蒸发；但由于培养条件和转化子表型不同，添加甲醇的量也有所不同，一般添加量为培养基体积的0.5％～1％。诱导时间过短则表达量很低，过长则外源蛋白的降解增加，应根据菌株的需要选择合适的诱导时间，一般诱导时间在150
h左右。另外，甲醇诱导表达时，培养温度不宜超过30℃。
7、产物稳定性
酵母细胞膜上有一种KEX-2样蛋白水解酶，能专一性水解a因子前体中羧基端的肽键，即连续两个碱性氨基酸(如
LySArg，LysLys，ArgArg，LsArg)，酵母基因工程表达产物发生降解现象的原因就在于此。改变培养基的PH值、加入适量的酵母提取物和蛋白胨或酪蛋白水解物，都能够提高外源蛋白的稳定性，而某些酶抑制剂如EDTA，虽然也能增加其稳定性，但却常会使一些原先并不明显的蛋白变得非常明显，影响其使用效果。
分泌蛋白的水解稳定性可通过改变培养基的pH来提高，实验 pH范围是2.8~6.5．在培养基中加入Casamino
acid或YP可大大提高产物的稳定性。例如，将培养基的pH从5.2增加到6.0，HSA的分泌水平可明显提高；若在培养基中加人YP，则产量可进一步增加。加5
mnoL／L EDTA到培养基也能提高产物的稳定性。利用S cerevisiae的PEP 4基因在P
pastoris中的同源区缺失菌，如SMDI168(his4，pep 4)、SMDl165(his4，prb 1)和 SMDl163(his
4，pep 4，prb
1)来提高产物的稳定性，如发酵罐中IGF-I的产量增加了约50％。而且，pep4突变菌株和野生型菌株生产的IGF-I纯化后发现，pep
4突变株培养基中的IGF-I更稳定，这就说明减步蛋白降解致使产量明显提高。
另外，使用蛋白酶缺陷株如SMD1163、SMD1165或SMD1168亦可避免产物降解的发生。虽然并不是每一种外源蛋白都会受内源性蛋白酶的影响，但在未知其有无降解可能的情况下可以考虑使用此种宿主菌。
在另外一种情况下，如果基因工程产物会影响宿主菌生长代谢活性的话，也可能出现高度降解的情况。如重组人基质金属蛋白酶3(MMP-3)被认为有促使哺乳动物上皮细胞凋亡的作用。它在Pp中高度降解，仅当与其组织抑制物TIMP-1共表达时才能保持稳定。这也提醒我们外源基因本身对产物稳定性的影响同样重要。
8、翻译后修饰
一般情况下Pp能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖链，且较均一，长度在8－14个之间，使产物更加稳定，而这正是Pp表达外源蛋白的一个优势。虽然糖基化对某些外源蛋白的活性没有太大影响，它却可能在蛋白折叠和抗蛋白酶降解中起重要作用。然而，糖基化也有其不利的一面。例如人红细胞生成素受体的胞外配体结合区(EPObp)因糖基化程度不同而呈两种状态(30X103和60X103)；人组织因子则在SDS-PAGE上以从37X103到
45X103的3个条带存在。另外，聚合体的存在也会成为产物不均一的原因，这些都给基因工程产物的纯化和工业化生产带来一定困难。从药物应用的观点来看，不合适的糖基化和寡聚体可能会在机体内产生免疫反应或毒副作用，并且会明显影响纯化过程中产率的提高，因此，选用一种能够获得单体均一形式的基因工程产物十分重要。这方面的研究仍有待探索。
9、发酵新策略
通过利用甲醇以提高生物量的连续发酵方式不适合Mut菌株。Craze JA和Prevatt WD在寻找促进生长、且不阻遏AOX
I基因启动子的甲醇诱导功能的碳源时发现，山梨醇和丙氨酸是两种最好的底物。最近利用山梨醇+甲醇混合培养基进行的分批发酵在Biostat-
B(Braun)台式微量发酵罐中完成MMP-2生产的几个循环，4wk内生产出25
L含MMP-2的培养基。该方法对Mut+细胞同样有效，因为它减少了甲醇的总消耗量，大多数的生长靠山梨醇来支持，甲醇可在任何需要的时间点添加到山梨醇中诱导表达
巴斯德毕赤酵母表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题，并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的翻译后蛋白加工，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。随着对巴斯德毕赤酵母表达系统的研究的广泛深人，该表达系统也将更完善。相信在将来的理论和实践中，如在分子生物学基础研究、基因工程产品开发、生物催化剂、生物制药等诸多应用领域中也必将发挥巨大作用。
作为一种正在发展中的表达异源蛋白的宿主体，Pp酵母菌兼有原核细胞的分子遗传操作和生长特性及真核生物的翻译后修饰机制的长处。虽然目前存在的诸多困难使得仍有许多蛋白难以在这个系统中成功表达，但随着对它的利用和探索的不断深入必将不断给我们增添新的见解，使我们有理由相信会最终解决这些困难，将巴氏毕赤酵母系统不断完善。
