甲醇酵母系统表达的影响因素-1
酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia
pastoris,
Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。已有许多细菌、真菌和高等动植物的基因在Pp中成功表达(如破伤风毒素片段Ｃ，12g/L)，但也有许多蛋白的表达量并不理想(如多瘤病毒大T抗原，0.5mg/L)，甚至不能表达(如HIV表面糖蛋白)。另外，酵母表达系统的局限性还在于分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在、信号肽加工不完全以及内部降解等现象。所有这些都提醒我们在Pp中表达外源蛋白时，应周密考虑影响其表达的各个因素。
甲醇酵母可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长。这是因为其细胞中含有甲醇代谢途径的必需酶，如醇氧化酶(AOX)、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，其中AOX是甲醇酵母利用途径中的第1个酶，它催化甲醇被氧化为甲醛和过氧化氢。过氧化氢进一步由过氧化
氢酶分解成水和氧。甲醛在胞浆内被甲醛脱氢酶(FMD)和甲酸脱氢酶(FMDH)氧化成二氧化碳，或者在5一磷酸木酮糖(Xu5p)、二羟丙酮合成酶
(DHAS)催化下形成3一磷酸甘油醛(GAP)和二羟丙酮
(DHAP)。DHAP与GAP在1，6-二磷酸果糖醛缩酶作用下形成1，6-磷酸果(FBP)。FBP又由1，5-二磷酸果糖酶去磷酸化生成Xu5p和
GAP。Xu5p又一次参加循环，而GAP有1／3进入主代谢途径，用于合成其他物质。
在甲醇酵母中，已克隆到2个编码高度同源的AOX1、AOX2基因，其中AoX1基因是利用甲醇的第1个酶基因，它的表达是在转录水平调控的。以甲醇为碳源时，生长的细胞中约
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的mRNA来自AOX1基因。AOX1基因的调控过程分两步：抑制机制加上诱导机制。简言之，在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转录；而在以甲醇为唯一生长碳源时，诱导基因转录和蛋白表达。甲醇酵母在含甲醇培养基上的生长速率与野生型类似，称为甲醇利用快型(Mut
)，如GS115 (his4)。当AOX1基因被其他基因取代时，则需依赖AOX2基因，AOX2与AOX1有97
的同源性，但甲醇代谢速度慢，称为甲醇利用慢型(Mut
)，如KM71。当AOX基因全部缺失，不能利用甲醇时，称甲醇利用负型(Mut-)如MCIO0-3。3型菌株在A0X1基因启动子调控下均可诱导异源蛋白的表达。
甲醇酵母生长的适宜温度一般为28~30℃，诱导期间如果温度超过32℃，则不利于蛋白表达，甚至会导致细胞死亡。以甘油或葡萄糖为碳源时，Mut+和Mut5。的生长速度并无区别；而以甲醇为碳源时，Mut+比 Mut5的生长快。
所有这些都提醒我们在Pp中表达外源蛋白时，应周密考虑影响其表达的各个因素：
1、外源基因自身的影响
外源基因的特性是决定表达成败的首要因素。外源基因序列中mRNA
5端非编码区(5r-UTR)的核苷酸序列和长度影响外源基因的表达。适当长度的5’非翻译区可极大地促进mRNA有效地翻译，5-UTR太长或太短都会造成核糖体40
S亚单位识别的障碍。AOX1基因5r-UTR长为1l4nt，并富含A+U，其编码的乙醇氧化酶表达量极高，故维持外源基因mRNA
5r-UTR尽可能和AoX1 mRNA 5-UTR相似是必需的，最好是保持两者一致。
A+T含量高的基因在甲醇酵母中表达时，有时会造成转录提前终止，共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号。另外在A+T丰富区还存在一些没有确定的转录提前终止信号。因而对A+T含量丰富的基因，最好是重新设计序列，使其(A+T)含量在30％~55％范围内。这种方法使人血清白蛋白(HAS)的表达量提高50倍左右。用这种方法可使破伤风毒素C片段得到高效表达。某些稀有密码子，尤其是稀有密码子密集区往往也成为制约翻译速率的因素，所以应该使稀有密码子突变为酵母所偏爱的密码子来提高表达效率，对这些偏好密码子的使用程度和基因表达水平成正比。因此，要得到高效表达，最好对外源基因进行改造，选用甲醇酵母偏好的密码子，尽量使mRNA5’非翻译区的核苷酸序列和长度与醇氧化酶的相似。
酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析基因表达的规律有重要意义，也可为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。如果外源基因密码子中存在过多的宿主低利用密码子，位于起始密码子附近
的低利用密码子对基因的表达就会产生很大影响。解决这一问题的方法有2种：一是通过点突变的方法用同义高利用率密码子替代低利用密码子而不改变氨基酸序列；另一方法是截取基因中影响其生物活性的部分。目前，这些方法在甲醇酵母表达系统中都能提高表达水平。
外源蛋白的空间构象、糖基化位点、水溶特性、氨基酸组成以及其他的理化特点都会影响毕赤酵母对其分泌，所以应根据外源蛋白自身的理化特点来选择胞内表达或分泌型表达方式。
外源基因在酵母基因组中的整合数也可以影响外源基因的表达水平，应该选用高拷贝整合来提高外源基因的表达水平。
