单克隆抗体培养—含有单克隆抗体的腹水制备
| 实验步骤 | 材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)裸 鼠 ， 6〜8 周龄，无 特 殊 病 原（SPF)，或者是同基因型宿主（注射小鼠-小鼠杂交瘤时） 姥 鲛 焼（Pristane， 2,6，10，14-四甲基十五焼； Aldrich 公司提供） 杂 交 瘤（单 元 1.3) 添 加 10 mmol/L HEPES 和 lmmol/L 丙酮酸钠的 DMEM-10 完 全（附 录 1 ) 培养基 PBS 或 HBSS，已消毒，不 含 FBS 1 0 % (m/V) 叠氮钠 18 G 和 20 G 或 22 G 注射针头 175 cm2 组织培养用细颈瓶 50m l 和 15 ml 塑料锥底离心管，无菌 Beckman 离心机和 TH-4 转 子（或同等设备） IOml 注射器，无菌 56°C 水浴 0.45um 过滤装置 1.于接种细胞前一周，用 20 G 或 22 G 针头给每一只小鼠腹腔内注射姥鲛烷 0.5〜lml。始终保证小鼠处于 SPF 设施中。远交系裸鼠虽然更加昂贵，但无需放射线处理；不一定必须使用近交系裸鼠。 2.在盛有添加的 10 mmol/L HEPES 和 lmmol/L 丙酮酸钠的 DMEM-IO 完 全（附 录 1)培养基的 175 cm2 培养瓶中增殖杂交瘤，保持细胞处于对数生长期。在 接 种 小 鼠（步骤 5 ) 之前，用 ELISA (单元 1 . 1 ) 或其他检测方法检测培养上清中 M A b 的活性，检测最好在细胞扩增之前进行。为了降低病原体进入鼠类细胞克隆的风险，应该用抗 体 形 成 实 验（CPI 单 元 1 . 1 ) 检测细胞中的病原体。 3.将培养物移入 50 ml 锥底离心管中。室温下， 500g离 心 5 min，弃上清。用 50m l 已消毒的不含 FBS 的 PBS 或 HBSS 重悬、洗涤细胞，并再次离心，弃上清。重 复 2 次后重悬细胞于 5 ml PBS 或 HBSS。 4.进行细胞计数，并用 台 盼 蓝 拒 染 试 验（附 录 3C) 检测细胞活力是否接近 1 0 0 % 。加入 不 含 FBS 的 PBS 或 HBSS 调整细胞密度为 2. 5 XIO6 个细胞/ml。 5.用 IOml 注射器抽取细胞。使 用 22 G 针头向裸鼠腹腔内注射 2m l 细胞 。注 射 3 只小鼠，通常至少会有一只且往往全部的小鼠都能产生含有 M Ab 的腹水。腹水的产生需1〜2 周 ；若需要最大量的腹水应多等待 3〜7d。 6.抽取腹水：用一只手抓取并固定小鼠，绷 紧 腹 部 皮 肤（附 录 2 0 。另一只手将一个18 G 的针头刺入腹腔 1〜2 cm。针头刺入时应选择左下腹或右下腹，避开上腹部的重要脏器和腹中线的大血管。在针头刺入之前应先确保针的尾部已对准 15m l 塑料锥底离心管，流出的腹水可以直接滴入离心管中。 7.若操作中出现问题，可以参考以下解决办法。 a. 若小鼠有大量的 腹 水 但 是 无 法 流 出 ，可 以 将 针 头 缓 慢 地 旋 转 ，或换一个位置插入。 b. 若没有腹水积蓄且小鼠的健康状况尚好，可以重新注射细胞。 c. 若没有腹水积蓄且小鼠死亡（尤其是在注射后 2 周内发生死亡），下次注射时减少细胞的量。 d. 若形成了实体的肿瘤，将肿瘤细胞打散、重悬 ，并用以注射另一只姥鲛烷预处理的小鼠。 e. 若只形成了少量的腹水，将其注射另一只预处理的小鼠（大 约 〇 .5 ml/只）。 8.室温下， 1500 g 离心腹水 IOmin。若液体在离心管内凝结，在离心前用细木棒在凝块与离心管壁间刮一圈，若凝块附在木棒上则将其丢弃，否则不做处理，离心后凝块将成为沉淀的部分。 9.取上清，弃沉淀。在所有腹水收集完之前将先离心得到的腹水保存于 4°C (不超过一周）。 10.让小鼠重新积蓄腹水（2〜3d) ，按照步骤 6 再次提取腹水，按 照 步 骤 8 对腹水进行处理。多次重复提取腹水，直到不再有腹水生成或小鼠死亡。将剩余的小鼠处死(附录 2 G)。 11.将之前多次抽取的腹水混合，在 56°C 水浴中热灭活 45 min。若有凝块形成，用步骤8 中的方法刮离、离心去除。 12.用适当的方法检测腹水的 M Ab 滴度。以 大 于 1 : 1 0 的比例稀释，并 用 0.45 um 过滤装置过滤除菌。若不对腹水进行生物学检测，则 加 入 1 0 % 的叠氮钠溶液至总量的0 . 0 2 % 。分装腹水 ， 一 70°C 冻存，并避免反复冻融，可以储存数年。 展 |
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