植物组织中过氧化氢含量的测定
实验概要
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量。
实验原理
H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。
主要试剂
100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 57μl，溶于100ml，再稀释100倍；
2mol/L硫酸；
5%（W/V）硫酸钛；
丙酮；
浓氨水。
主要设备
研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。
实验材料
受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。
实验步骤
1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表1加入试剂。
表1 测定H2O2浓度标准曲线配置表
试剂（ml） | 离 心 管 号 | ||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
100μmol/L H2O2 | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
4℃下预冷丙酮 | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
5%硫酸钛 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
浓氨水 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
3000r/min 离心10min，弃去上清夜，留沉淀 | |||||||
2mol 硫酸 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。
2.样品提取和测定：
(1)称取新鲜植物组织2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。
(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。
(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
3.结果计算： 植物组织中H2O2含量(μmol/g Fw)= (C*Vt) / (FW*V1) 式中 C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度（μmol）； Vt—样品提取液总体积（ml）； V1—测定时用样品提取液体积（ml）； FW—植物组织鲜重（g）。
