细胞冷冻保存
实验概要
细胞的冷冻保存
实验材料
材料：
1 生长良好之培养细胞
2 新鲜培养基
3 DMSO (Sigma D-2650)
4 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)
5 0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
6 血球计数盘与盖玻片
7 等速降温机(KRYO 10 Series II)
实验步骤
步骤：
1 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
2 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。
3 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。
4 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量
细胞悬浮液作污染检测。
5 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 10 分钟→ -20 oC 30 分钟→ -80 oC 16～18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。
6 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。
注意事项
注意事项：
1 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 – 90 ％致密度。
2 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
3 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4 ℃ 避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
6 冷冻保存之细胞浓度：
6.1 normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
6.2 hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。
6.3 adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
6.4 other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。
7 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
8 冷冻方法：
8.1 传统方法: 4 ℃ 10 分钟---> -20 ℃ 30 分钟---> -80 ℃ 16 - 18 小时(或隔夜)---> 液氮槽vapor phase 长期储存。
8.2 程序降温：利用等速降温机以–1 ～ -3 ℃ /分钟之速度由室温降至–120 ℃ ，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。
