脉冲场凝胶电泳的分子质量标准
实验方法原理 PFGE 用于分离很大的 DNA 分子，因而需要很高分子质量的标准。这种标准可以按照 Lauer 等（1977 ) 介绍的方法从噬菌体，如 T7 (40kb)、T2 (166kb）和 G (758kb) 提取获得。但是一个更好的覆盖范围更广的系列标准是 λ 噬菌体 DNA 的系列串联体。后面介绍的具体步骤是 Vdlrath 和 Davis (1987) 方法的改进。
实验材料 噬菌体 T4 DNA 连接酶纯化的噬菌体 λDNA
试剂、试剂盒 ATPDithiothreitolEDTA连接缓冲液低熔点琼脂糖缓冲液聚乙二醇TE
仪器、耗材 低熔点（LMT ) 琼脂糖Tygon 管水浴
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
ATP ( 0.1 mol/L)
Dithiothreitol ( 1 mol/L)
EDTA ( 0.5 mol/L, pH 8.0)
含聚乙二醇的 1X 连接缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH7.6)，1 mmol/L ATP，10 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，10 mmol/L MgCl2，2% PEG 8000）
低熔点琼脂糖缓冲液（100 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)，20 mmol/L MgCl2）
MgCl2 ( 20 mmol/L)
聚乙二醇（8%, m/V，PEG 8000 溶液）
TE (pH7.6)
2. 酶和缓冲液
噬菌体 T4 DNA 连接酶
3. 凝胶
低熔点（LMT ) 琼脂糖
4. 核酸和寡核苷酸
纯化的噬菌体 λDNA
5. 专用设备
Tygon 管
56℃ 水浴
二、方法
1. 在 10 ml LMT 缓冲液中通过沸水浴或微波加热溶解 0.1 g 低熔点琼脂糖。冷却到 37℃。
2. 在 172.5 μl TE (pH 7.6) 中溶解 10 μg 纯化的噬菌体 λDNA, 加热该溶液至 56℃ 5 min。
3. 冷却溶液到 37℃，迅速按顺序加入下述试剂：
8%PEG8000 62.5 μl
20 mmol/L MgCl2 5.0 μl
0.1 mol/L ATP 5.0 μl
1 mol/L DTT 5.0 μl
噬菌体 T4 DNA 连接酶 0.5 Weiss 单位
1% LMT 琼脂糖溶液 250 μl
聚乙二醇起集聚剂的作用，增加连接效率。
4. 混合物吸入一个稍短的 Tygon 管，在冰上冷却至琼脂糖完全凝结。
5. 将凝胶栓移入一个无菌的一次性塑料管内，其中有 3 倍体积的含聚乙二醇的1x 连接缓冲液。
6. 凝胶栓在连接缓冲液内室温温育 24 h, 然后转移到 10 倍体积 20 mmol/L EDTA ( pH 8.0）的试管内。
7. 在 EDTA 中温育 1 h, 再将凝胶栓转移到新鲜 10 倍体积 20 mmol/L EDTA (pH 8.0) 的试管内。
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