脉冲场凝胶电泳实验——倒转电场
脉冲场凝胶电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的,可分离长至5Mb的DNA分子,其工作原理是DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。较小的分子重新定向较快,因而在凝胶中移动也较快,于是不同大小的分子被成功分离。
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 制备用于水平电泳的1%琼脂糖凝胶,放入电泳装置,其上覆盖以2~3 mm 的GTBE或TBE缓冲液。
2. 加入液体样品。装好蠕动泵用于电泳缓冲液循环。
5. 将可编程的转换装置与恒压直流电源相连,然后将凝胶装置与转换装置相连(见下表),开始电泳直到溴酚蓝迁移1 cm,开启转换装置及蠕动泵。
6. 与标准的琼脂糖凝胶一样进行溴化乙锭染色及照相。经酸处理使DNA脱嘌呤后,凝胶可进行Southern杂交。
(1)这些公式假定使用0.5xTBE缓冲液;对于GTBE和TAE缓冲液,分离的片段将稍大,并且电泳速度分别要快约20%和30%。
(2)变量:T,温度(℃);V,电场通度(V/cm);A,琼脂糖百分浓度(对于脉冲场级琼脂糖乘以0.8);脉冲时间(对于倒转电场凝胶指反向时间,单位s);R,正向与反向电泳时问比率;θ,改向角度。 |