ac4C荣登Nature-RNA修饰研究大有可为
RNA修饰是表观遗传学中调控转录后基因表达的关键过程，目前对m6A RNA修饰的研究已进行的如火如荼，但除了m6A以外仍有多种RNA修饰类型参与调控转录后的基因表达，其中包括m1A、m5C、m7G、2’-O-甲基化修饰以及ac4C乙酰化修饰，在这些领域的研究中也不断有高 分文章的出现（如表1）。2020年6月17日，美国国立卫生研究院的Schraga Schwartz研究团队在《Nature》上发表了关于ac4C的研究成果，发现定量交叉进化图谱揭示了乙酰化修饰在RNA中的动态变化。今 天我们将着重介绍该项研究以及新发表在《Cell Host &Microbe》上的关于ac4C乙酰化修饰的文章，从而带大家把握这一领域的新进展。
表1：近期RNA修饰文章列表
文章展示
ac4C——定量交叉进化图谱揭示乙酰化修饰在RNA中的动态变化
发表期刊：Nature
影响因子：42.778
发表时间：2020.06.17
实验方法：Nucleotide-resolution ac4C sequencing
文章链接：Dynamic RNA acetylation revealed by quantitative cross-evolutionary mapping
ac4C是一种古老且高度保守的RNA修饰，存在于tRNA和rRNA上，近期在真核生物mRNA也有相应的研究。然而胞苷乙酰化的分布、动力学和功能还有待进一步阐明。2020年6月17日，美国国立卫生研究院的研究团队在《Nature》发表了题为“Dynamic
RNA acetylation revealed by quantitative cross-evolutionary mapping
.”的研究成果，文章中使用N4-乙酰胞苷（ac4C）-seq，这种化学基因组学方法在单核苷酸分辨率下对ac4C进行全转录组范围的定量。揭示了ac4C乙酰化研究的新进展，为阐明这种修饰在生物学和疾病中的作用提供了技术基础和理论依据。
(1) ac4C单核苷酸分辨率测序
为了定量研究转录组中的胞苷乙酰化，作者开发了一种能够灵敏检测ac4C的化学方法在单核苷酸分辨率上对ac4C进行全转录组范围的定量。在前面研究的基础上，作者发现ac4C和氰基硼氢化钠(NaCNBH3)在酸性条件下反应形成还原的N4-乙酰四氢胞苷。与ac4C相比，这种核酸碱基结构的改变导致逆转录时错配形成其他脱氧核苷三磷酸(dNTPs)，且可通过cDNA测序检测出来。与之前的化学反应相比，该反应显示出更快的动力学，并导致已知ac4C的错配掺入到rRNA中。关键的是，ac4C在分析前用温和的碱水解(化学法脱乙酰化)修饰时，未观察到相应的突变。将这些化学反应与二代测序相结合，促成了ac4C-seq的发展，形成了一种能够对ac4C在单核苷酸分辨率上进行全转录组定量分析的方法。本文中作者报道了N4-乙酰胞苷测序ac4C-seq这种用化学基因组方法在单核苷酸分辨率上对ac4C进行全转录组定量的应用。
图例1：ac4C-seq流程的示意图
(2) 古细菌RNA中检测到ac4C修饰的空前水平
作者利用液相色谱-质谱联用(LC-MS)对古生超嗜热菌的总RNA的交叉进化分析显示ac4C浓度很高。基于此，作者应用了ac4C-seq定量绘制了在85℃的生长温度下培养的柯达卡兰的胞苷乙酰化图，发现ac4C的修饰分布于rRNA、tRNA、非编码(nc)
RNA和mRNA并达到了前所未有的水平。为了了解RNA乙酰化是否是古细菌极端微生物的共同特征，作者使用了ac4C-seq分析了糠秕热球菌和热球菌中的RNA乙酰化修饰水平，结果表明ac4C在热球菌的每个群体中广
泛存在且在数百个不同的位点发生修饰。此外也验证了在古细菌热球菌中ac4C不仅广
泛存在，而且ac4C发生的的位置也高度保守。这些研究确定了古生序热球菌中普遍存在的RNA乙酰化及其调控机制。
图例2：ac4C在不同古细菌物种中的ac4C修饰水平
(3)古细菌RNA乙酰化的动态变化
为了研究ac4C是如何被环境影响，作者使用ac4C-seq鉴定了在55-95℃的环境下培养的科柯达卡兰菌种乙酰化修饰水平。结果发现，ac4C在温度升高时被明显诱导，而缺乏乙酰转移酶的古细菌菌株表现出温度依赖的生长缺陷。此外，冷冻电子显微镜观察野生型和缺乏乙酰转移酶的古细菌核糖体的结果也为ac4C的温度依赖性分布及其潜在的热适应作用提供了结构上的证据。作者的研究也定量地显示了ac4C修饰的整体水平，为阐明这种修饰在生物学和疾病中的作用提供了技术和概念基础。
图例3：不同温度处理古细菌时ac4C修饰水平的动态变化
ac4C——胞苷残基乙酰化通过增加病 毒RNA的稳定性促进HIV-1基因的表达
发表期刊：Cell Host &Microbe
影响因子：15.923
发表时间：2020.08.12
实验方法：ac4C RNA乙酰化测序
文章链接：Acetylation of Cytidine Residues Boosts HIV-1 Gene Expression by Increasing Viral RNA Stability
表转录组RNA修饰，包括腺嘌呤和胞苷残基的甲基化，被认为是细胞和病
毒mRNA功能的关键调节因子。此外，近期有报道称ac4C可以增加细胞mRNA的翻译和稳定性。2020年8月12日，杜克大学医学中心Bryan团队与北卡罗来纳大学Ronald团队在《Cell
Host & Microbe》上发表了ac4C在HIV-1病 毒感 染中的重要作用的研究，本文中作者认为ac4C以及N
-乙酰转移酶10 (NAT10)会被人类免疫缺陷病 毒1 (HIV-1)破坏以增加病
毒基因表达。HIV-1转录本能在多个离散位点被ac4C修饰，这些ac4C位点的沉默突变导致HIV-1基因表达下降。同样，NAT10缺失导致的病
毒转录本ac4C缺失通过降低病 毒RNA的稳定性抑 制了HIV-1的复制。有趣的是，NAT10抑 制剂在浓度对细胞活力没有影响的情况下，可以抑
制HIV-1的复制，因此添加ac4C修饰将成为抗病 毒药物开发的潜在方向。该研究为HIV的治
疗提供了潜在的新靶点，也为深入了解表观转录组提供了方法学的指导。
图例4：NAT10 对HIV-1病 毒的ac4C修饰影响mRNA表达
(1)HIV-1上依赖于NAT10的ac4C修饰
作者首先使用ac4C -seq分析了HIV-1转录本和来自CEM细胞和初级CD4+ T细胞RNA中的乙酰化修饰水平，发现ac4C位点同时存在于病
毒和细胞RNA上影响mRNA稳定性，因此研究者通过分析HIV表达来间接反映ac4C修饰对病
毒RNA的影响。.然后作者使用CRISPR-Cas基因编辑敲除了ac4C转移酶NAT10，在NAT10敲除细胞中可以明显观察到病
毒Gag结构基因、病 毒RNA表达量下调，荧光素酶也具有相似的实验结果。此外，作者也利用NAT10的抑
制剂Remodelin在正常细胞中重复了这一过程，并且发现添加了抑 制剂能够降低70%的HIV复制，而对NAT10细胞病
毒复制不起作用，因此NAT10可能是HIV的重要辅因子。
图例5：依赖于NAT10的ac4C沉积在HIV-1 RNA的多个位置
(2)NAT10对HIV-1转录本表达的影响
为了进一步研究依赖于NAT10的ac4C修饰在HIV感 染中的作用，作者进行了NAT10的过表达/功能缺失实验，结果发现NAT10过表达细胞中HIV-1的转录本明显高于其他组。为了研究NAT10是如何调节HIV复制的，作者进行了一个单周期使用WT或nat10突变株进行HIV-1复制实验并测量HIV-1复制周期中不同步骤的效率。结果发现，nat10突变株中表达减少约70%，表明NAT10的影响主要在RNA水平。此外通过脉冲追踪、放线菌素D抑 制转录发现NAT10/ac4C实际是通过影响HIV-1转录本稳定性，来调节基因的表达。
图例6：NAT10敲除影响对HIV-1转录本稳定性
(3)ac4C修饰对HIV的影响
之前的研究发现ac4C除了影响mRNA稳定性，还可以提高翻译效率从而提高细胞内mRNA的表达。为了确定是否只有CDS中存在的ac4C位点才会影响cis中的mRNA功能。作者将病
毒的env基因区域多个ac4C修饰保守位点中的C突变为U，并转染CD4阴性293T细胞，检测了HIV-1中Gag蛋白的表达，并发现其表达下调。说明突变了ac4C修饰位点会抑
制HIV-1中Gag蛋白的表达。
图例7：ac4C位点的沉默突变降低了病 毒Gag的表达
