广州大学王家海:在纳米孔领域获得一系列成果
王家海教授简介
王家海，广州大学化学化工学院教授、研究生和博士后导师，2008年5月美国University of Florida化学系毕业，师从Charles R. Martin；2008年5月至2009年1月，美国约翰霍普金斯大学化学生物工程系博士后，从事微纳米器件加工课题，致力于智能器件的设计及其应用性能的探讨；2009年1月至2014年8月，分别在中科院苏州纳米所和长春应用化学研究所任副研究员，从事体外诊断纳米孔检测相关的技术开发。2014年10月加入山东大学，任研究员，从事氢能源催化剂材料的开发。2017年至今加入广州大学，百人计划教授。入选中国科学院首批促进会会员，广州市高层次青年后备青年人才，全球顶尖十万科学家之一。目前团队研究方向包括能源催化材料、锂电池、生物化学传感器、纳米孔单分子计数器和5G通讯。代表性成果发表在Advanced Materials、Biosensor and Bioelectronics、J. Am. Chem. Soc.、Nano Letters 等国际著名期刊上。
经过30多年的发展，纳米孔在核酸测序领域已经成功实现商业化，在分子诊断领域（分析化学）也取得了巨大的进步。期间，研究者发展了不同种类的纳米孔，包括蛋白质纳米孔、高分子纳米孔、玻璃纳米孔和各种无机薄膜纳米孔。于此同时，理论研究和各种功能化技术也逐渐完善。研究内容从核酸测序扩展到对药物小分子、蛋白质、核酸碱基突变及其他一些重要的对象进行检测。
本文主要介绍王家海教授团队在纳米孔领域取得的一系列进展和成果。
（一）将纳米孔的离子整流现象运用到分析化学，提高纳米孔的应用范围和深度
2008年之前，基于纳米孔的分子检测主要使用电阻脉冲方法（Resistive-pulse method）（图1）：在纳米孔两边施加电压时，纳米孔一端的离子在电场的作用下通过纳米孔，可观察到稳定的恒电流；当带有一定体积和电荷的探测物存在于溶液中时，电场的作用使其通过纳米孔，纳米孔中的离子浓度临时改变，可观察到一系列的电阻脉冲峰（Resistive pulse）。根据峰的大小、持续的时间和频率，即可对探测物进行定量和定性测量。
图1. 基于蛋白质纳米孔的电阻脉冲方法。
电阻脉冲方法高度依赖纳米孔的孔径、稳定性、长度和表面的电荷及表面功能基团。譬如用于基因测序的蛋白质纳米孔，孔径只有两纳米左右。这些苛刻的要求，限制了该方法广泛用于生物体系中不同对象的探测及其实用化。因此发展新方法能使纳米孔分析化学应用更广泛和深入。2008年，为了提高纳米孔在分析化学上使用范围和深度，把离子整流现象运用到分析化学（Nanomedicine, 2008, 3, 13-20）。相关工作两次在国际大会进行专题报告。离子整流方法：在锥形纳米孔（带负电）两端实行电压扫描时，观察到一个非线性的电流对电压的曲线（I-V curve）；把带正电的探测物置于溶液，探测物会选择性吸附到锥形纳米孔内表面，探测物改变或逆转了孔内表面电荷数目，当再次对锥形纳米孔两端实行电压扫描时，会观察到一个改变的非线性的电流对电压的曲线，通过对电流改变值进行分析，即可对探测物进行定量分析（图2）。
图2. 基于锥形纳米孔的离子整流方法。
随后，该团队进一步把这个原理运用于探测不同疏水性药物小分子（Talanta, 2012, 89, 253-257）。药物检测原理如下（图3）：（1）当不断改变药物分子在锥形纳米孔小端一侧的浓度时，观测到一系列变化的电流电压曲线。当药物分子达到一定值时，药物在纳米孔内的吸附达到饱和，电流电压曲线不再发生变化，这时候表面覆盖率达到1。（2）没有药物分子的时候，药物表面覆盖率为0，电流电压曲线为黑线。对应一定药物浓度的表面覆盖率，可以利用特定电压所对应的电流计算。（3）表面覆盖率与药物在溶液中的浓度和药物与表面的结合常数相关联。（4）如果以表面覆盖率为Y轴，药物浓度为X轴，结合Langmuir方程式，就可以拟合出药物与薄膜内表面的结合常数。不同疏水小分子在薄膜上的吸附能力不一样，所以可以用电流电压曲线区分不同小分子（图4）；小分子Hoechst 33342 在20微摩尔时薄膜内表面吸附达到饱和（图4A），分子Propidium Iodide 在1毫摩尔时薄膜表面吸附达到饱和（图4B）。分子Bupivacaine hydrochloride 在8毫摩尔时在薄膜内表面吸附达到饱和（图4C）。
图3. 离子整流定量检测药物分子。（A）不同浓度的药物引起不同的离子整流和电流电压曲线。（B）药物在纳米孔表面的覆盖率可以通过相对电流改变量计算。（C）药物表面覆盖率与溶液中的药物浓度和药物与表面的结合常数通过Langmuir方程式相关联。（D）如果以表面覆盖率为Y轴，药物浓度为X轴，结合Langmuir方程式，就可以拟合出药物与薄膜内表面的结合常数。
图4. 区别不同疏水性带正电的药物小分子。（A）对应于小分子Hoechst 33342的电流电压曲线图和相应的表面覆盖率随药物浓度变化图。（B）对应于小分子Propidium Iodide的电流电压曲线图和相应的表面覆盖率随药物浓度变化图。（C）对应于小分子Bupivacaine hydrochloride的电流电压曲线图和相应的表面覆盖率随药物浓度变化图。
相对于电阻脉冲方法，离子整流方法带来新的期待，它对纳米孔大小、表面修饰、膜厚度的要求都比电阻脉冲方法宽松很多。尽管如此，离子整流仍然需要更进一步的发展：高分子膜中50纳米以下纳米孔在电镜的观测下，会变形，测量不准，误差很大，且操作费事；高分子膜表面的疏水性影响了探针分子的修饰，纳米限域内的分子探针修饰无论是成功率还是重现性都比开放表面修饰差很多；基于高分子纳米孔离子整流，离子整流的整流系数变化还不太理想，使整个体系的检测限与其他表面技术和荧光方法相比较，还有一定差距；离子整流的应用范围需要继续扩展。
（二）发展基于光透射技术的纳米孔孔径测量方法
此前常用的表征核孔膜孔径的方法有电子扫描显微镜（SEM）和光学显微镜。SEM测试费用昂贵，操作时间长。光学显微镜只能测量微米尺度以上的物体。况且这两种方法都不能够实现在线监测。为了纳米孔孔径测量更方便，测量时孔径不变化，该团队发展了一种基于光透射技术的测量方法（Chem. Commun., 2013, 49, 11451-11417）。
运用紫外分光光度计测量出核孔膜的大小（图5），可以覆盖50纳米到1微米的区间，有望填补在线检测核孔膜生产的技术空缺。该团队发明的这个方法，优势在于简单（图6），可以生产出微型化的装备快速检测孔径大小（图7），主要运用于高分子核孔膜的制备与表征（Track-etched Membrane），实现实时在线检测。该团队已经基于该方法开发了相关检测仪器，已经与企业开始技术转化洽谈。[1]
图5. 核孔膜孔径在增大的过程中孔的周边会有一个缓冲带，这个区域会随着孔径增大而同时变大，会反射光。逐渐增大的缓冲带会使薄膜越来越不透明。
图6. 薄膜仅仅需要放在紫外样品池支架上（静电吸附）。
图7. 核孔膜孔径与光反射log值呈现良好的线性关系。
（三）设计无探针修饰的纳米孔分析平台，消除限域纳米孔内立体阻碍的干扰
高分子膜表面的疏水性影响了探针分子的修饰，纳米限域内立体阻碍对探针和被测物之间的相互作用有很大的影响，造成纳米限域内分子探针修饰无论是成功率还是重现性都比开放表面的修饰差很多。针对这个不足之处，该团队设计了无探针修饰的纳米孔分析平台（Microchim. Acta, 2015, 59, 4946-4952; Talanta, 2015, 140, 219-225; Biosens. Bioelectron., 2015, 63, 287-293; J. Mater. Chem. B, 2014, 2, 6371-6377）。
在运用纳米孔作为检测平台时，探针修饰是常用的做法，但这种方法有不足之处，譬如纳米孔内表面的立体阻碍，影响检测限的优化。纳米孔内高电场也影响了探针在孔内的稳定性。在该团队的工作中，探针游离在溶液当中，可以高选择性的和目标对象结合（多余的探针被单碳纳米管除去），只有结合了目标物的探针才能被纳米孔吸附，从而改变纳米孔表面的电荷，因此能用纳米孔选择性检测目标分子。这个新方法的优势在于，探针与目标对象的作用完全在溶液中，不受表面影响。将该方法用于对三价镉离子的探测，仅仅通过选择适当的缓冲溶液就可以做到。
图8. （a-c）在纳米孔表面吸附高分子PEI，然后吸附Zr4+离子，纳米孔具备吸附核酸探针的能力；（d）与探测物结合的核酸适配体吸附到纳米孔表面，没有与检测对象相结合的自由核酸适配体被单壁碳纳米管吸附带走。纳米孔表面的电荷改变可以通过离子整流探测。
基于高分子的纳米孔整流器容易发生非特异性吸附，尤其是含有胺基的小分子容易吸附在纳米通道表面，这会降低纳米通道传感器的效率。该课题组利用主客体相互作用来消除过量小分子的影响，在检测三聚氰胺中利用环糊精（Cyclodextrin）解决了这一个问题。与单壁碳纳米管（SWNTs）相结合，β-环糊精（β-CD）为涂覆有聚乙烯亚胺（PEI）和锆离子（Zr4+）的锥形纳米通道提供了优异的传感性能。以三聚氰胺为检测对象，制备的纳米通道可以选择性检测三聚氰胺诱导的双链DNA（dsDNA）（Biosens. Bioelectron., 2019, 127, 200-206）。全部工作在广州大学完成。
图9. 环糊精可以屏蔽三聚氰胺的非特异性吸附。
（四）借助纳米通道支撑基底，发现高分子膜材料上具备完美的离子二极管效应和离子整流现象
高分子纳米孔离子整流系数变化不够大，其检测能力与其他表面技术和荧光方法还有一定差距。通过提高纳米孔的离子整流效率可以进一步降低检测限。借助纳米通道基底，该团队发现气体高分子响应膜材料上完美的离子二极管效应和离子整流现象（RSC Adv., 2015, 5, 35622-35630）。
二极管效应早先是电子二极管很重要的一种现象，有广泛的应用实例。在后来的蛋白质纳米通道中也发现了二极管效应，与电子二极管不同的是电流的载体是离子，这种效应是离子二级管效应，其原理也被其他人工材料采用。本文发明了一种全新的离子二极管，并用新的物理化学机理解释了超薄气体响应高分子膜的这种离子二极管效应。该高分子膜除了可以应用在油水分离、海水淡化和能源隔膜等领域中，对应用在分析化学中也是很有前景，其离子整流系数达到几万倍，几乎接近完美。
图10. （A）和（D）核孔膜电镜图（200 nm），（B）和（C）长满高分子膜的PET膜的上下两面。（E）和（F）高分子膜的厚度（1.6 μm）。
图11. 只要调换溶液和控制电压方向，就可以制备可开关的离子二极管。电压方向可以控制离子在薄膜附近的浓度，从而引起薄膜亲水或者疏水。
（五）运用离子整流解释高分子薄膜内羧基可以带正电
纳米孔分析化学的应用范围需要继续扩展，譬如运用离子整流观测表面化学反应，把纳米孔集成到微小器件中用于体内检测。2011年该团队运用离子整流解释了高分子薄膜内羧基可以两步质子化反应带正电（Nanoscale, 2011, 3, 3767-3773）。发现不对称锥形纳米孔内新的物理和化学性质：聚脂薄膜内表面的羧基可以通过两步质子化使薄膜内带负电荷、呈中性、带正电荷三种状态。该工作打破了近十年的传统观念，以前认为薄膜内表面只能具备带负电荷、呈中性两种状态。表面羧基（COOH）是由NaOH刻蚀聚脂薄膜PET产生的，在中性溶液中薄膜内表面带负电荷（COO-），在溶液pH 下降到3 或更低时，电流电压曲线发生反转。要通过电流电压曲线观测到这个现象，需在比较宽电压范围内扫描。
图12. 不需要生物化学修饰的离子整流器。（A）锥形纳米孔图，（B）薄膜表面电荷性质发生变化。
（六）将二维纳米孔折叠成三维微米器件，用于细胞培养和药物释放
目前基于纳米孔的分析检测都是在体外进行，要想将更加先进的检测技术运用到体内，必须和能用于体内的其他智能化的微小器件相结合。该团队曾经把二维的纳米通道折叠成三维的微米器件（Nano, 2009, 4, 1-5）。这种立体盒子的每个面都带有纳米孔，可以进一步功能化。该立体盒子（微米）可以用作细胞存放的容器，譬如能产生胰岛素的细胞。盒子的每一面的纳米孔都能感知周围的环境，根据需要用于营养成分的交换，保证盒内的细胞正常生长，并且在体内为患者提供源源不断的胰岛素。还可以把其他的药物分子放入微米器件内，为患者提供帮助。该工作只是初步的把纳米孔和其他先进器件相结合，后续的应用还需要更多的研究工作。
图13. 三维纳米孔器件。
（七）小分子功能化的纳米孔通道可以调控离子流
在家禽业中滥用金刚烷胺（ADA）及其衍生物作为兽药，可能会给人类带来严重的健康问题。因此，迫切需要开发一种快速、廉价、超灵敏的ADA检测方法。该团队建立了一种灵敏的锥形纳米通道传感器，利用主客体竞争的独特设计快速定量检测ADA。该传感器使用对甲苯胺类对纳米通道表面进行功能化来构建，然后用葫芦素（Cucurbit[7]uril，CB[7]）组装而成。当ADA加入时，由于主客体的竞争，它会占据CB[7]的空腔，使CB[7]从CB[7]-p-甲苯胺类络合物中释放出来，导致纳米通道的疏水性发生明显变化，这可由离子电流确定。在最佳条件下，该策略允许在10-1000 nM的线性范围内灵敏检测ADA。基于纳米通道的ADA传感平台具有高灵敏度和良好的重复性，检测限为4.54 nM。该文首次利用纳米通道系统实现了基于主客体竞争的非法药物快速、灵敏的识别，并详细阐述了该方法的原理和可行性。该策略为将主客体系统应用于小分子药物检测纳米通道传感器的开发提供了一种简单、可靠、有效的方法（Talanta, 2020, 219, 121213）。全部工作在广州大学完成。
图14. 葫芦素调控的纳米孔检测三维金刚烷胺（ADA）。
（八）核酸纳米结构作为纳米孔信号传导载体检测病毒基因片段
运用纳米孔直接检测小分子或者其他目标对象挑战性非常大，如果把对目标对象的检测转化成对核酸纳米结构的检测，可以解决很多以前不能解决的问题（Analyst, 2022, 147, 905-914）。特别是，具有明确三维纳米结构的DNA四面体是用作信号传感器的理想候选。该团队展示了在反应缓冲液中检测HPV18的L1编码基因作为测试DNA靶序列，其中连接DNA四面体到磁珠表面的长单链DNA被靶DNA激活的CRISPR-cas12系统切割。DNA四面体随后被释放，可以通过玻璃状纳米孔中的电流脉冲进行检测。这种方法有几个优点：（1）一个信号传感器可以用来检测不同的目标；（2）孔径比目标DNA片段大得多的玻璃状纳米孔可以提高对污染物和干扰物的耐受性，避免纳米孔传感器性能的降低。
图15. 纳米孔结合CRISPA-cas12 检测病毒片段。
