临床检验技术发展及其在耐药基因检测中的应用进展
刘晓燕 (公安县人民医院检验科，湖北公安434300)
王 红 (湖北中医药大学医学检验与技术学院，湖北武汉430065)
一份准确全面的医学检验报告是医生做出准确诊断与制定正确治疗方案必不可少的依据。因此，临床医学检验是一门极其重要的医学学科。笔者对临床医学检验技术的发展状况及新技术在细菌耐药基因检测中的应用作简要综述。
1 临床检验技术的发展特点
2O世纪4O年代前，我国医学检验基本上为一片空白，大多数医院未设立专业的检验科室或只是开展极其简单的检验项目。5O年代才开始有医学检验专业。1982年，我国正式成立卫生部临床检验中心，为国内外临床检验质量控制方法和质量管理经验交流建立了平台，使国内的临床检验走上了规范化和标准化的道路。近二十年来，随着科学技术的发展和计算机技术的广泛渗透，最新的生物技术和生物信息研究成果不断地进入到临床实验室。现代临床检验技术主要有以下特点。
1．1 检验技术操作的自动化程度日益提高现代临床检验医学已经从以前的手工操作和简单的生化测试方法，转变成今天的全自动化设备，能够检测多种生化、免疫等指标，并能检测疾病相关基因，成为一门涉及多领域的学科。在现代临床检验实验室中，全自动生化测试仪、全自动血细胞分析仪、自动凝血仪、自动免疫测试仪、质谱仪等已经成为不可缺少的组成部分。现代化仪器的使用，加快了临床检验发展的速度，提高了准确率和精确度，同时减轻了工作人员的劳动强度。
1．2 免疫标记技术、荧光技术和分子生物学的迅速发展 8O年代后期至9O年代，免疫比浊测定、凝集试验、沉淀试验发展到免疫荧光技术、放射免疫技术、酶免疫试验、化学发光免疫技术、胶体金和胶体晒免疫技术、蛋白质印迹、蛋白质芯片、蛋白质飞行质谱和流式细胞技术纷纷应用于临床，大大提高了检测灵敏度和检测范围。2O世纪中期开始，分子生物学拉开序幕，从DNA双链结构的发现，限制性核酸内切酶的应用，到DNA测序方法的成熟和PCR技术的诞生，分子生物学的发展使生物医学研究和临床诊断进人了一个新的时代 。
2 分子生物学技术在耐药基因检测和定位中的应用
2．1 聚合酶链反应 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种快速在体外从某种来源的模板DNA 中扩增目标DNA的通用方法，是最常用的分子生物学技术之一。可用该技术对细菌核酸内已知的耐药性基因进行筛查和验证。利用商品试剂盒从细菌中抽提的基因组、质粒，纯度和浓度均很高，可作为稳定的DNA模板，通过挑取菌落煮沸裂解直接得到细菌DNA模板，方便快捷，适合大批量地进行耐药基因筛查[2]。引物的特异性以及扩增体系和条件对于PCR的特异性和敏感性非常重要，每次实验中均应包含阳性对照样本和阴性对照样本。
2．2 核酸杂交核酸杂交(molecular hybridization)是分子遗传学的基础研究工具，利用的是单链核酸分子问能退火形成双链分子(tO就是杂交)的能力。能形成双链分子的单链分子间必须有高度的碱基互补配对。通常是利用一段被标记的核酸分子作为探针(probe)，在许多未经标记的核酸分子混合物中鉴别同源DNA或RNA分子。通常将细菌菌落直接转移到滤膜上杂交，探针可采用同位素、地高辛或者生物素标记。核酸杂交还可以用于耐药基因定位。将细菌抽提出的质粒通过琼脂凝胶电泳、转膜并用特异性耐药基因探针进行杂交，观察质粒在电泳图上的位置是否存在杂交信号可以判断该耐药基因是否定位于质粒[3]。
2．3 酶切克隆PCR和核酸杂交只能对已知的耐药基因进行筛查和验证，如果需要寻找未知的耐药基因，可以利用酶切克隆和抗生素筛选的方法。通常对于具有抗生素耐药表型的细菌，首先挑选合适的片段连接人载体(如质粒，噬菌体)，通过该耐药表型抗生素筛选重组子可以获得携带耐药基因的质粒，最后对所获得的质粒进行测序，明确耐药基因的具体信息[4]。实验的关键点是所挑选的内切酶必须有比较合适的切点，即酶切片段大小要适中，片段太长不易连接入载体，而片段太短则不能包含完整的基因序列，导致缺乏耐药表型[5]。
2．4 全基因组测序随着测序技术在近几年的飞速发展，获得一个物种的全基因组序列已经不是非常困难的事情，特别是相对简单的细菌基因组。明确耐药株的核酸全序列之后，．可以在基因组的水平对基因分布、代谢途径、调控通路有一个全局性认识，特别是可以明确耐药基因的进化和传播机制，深入了解目前广泛存在的细菌泛耐药问题。比较传统的方法是先构建全组基因组DNA文库，利用载体克隆大量的文库DNA片段进行毛细管电泳测序，再将测序片段进行拼接以获得完整的基因组全长[6]。
近两年来，基于芯片技术的新的全基因组测序技术也已兴起。Smith等口 运用此技术成功地完成了全长3976746个碱基对对的鲍曼不动杆菌基因组测序工作。
随着分子生物学技术的不断发展，其在细菌耐药性研究中的应用日益广泛，将对揭示细菌耐药性产生及流行的分子机制，控制耐药细菌流行播散发挥日益强大的作用。
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