单细胞精度解析人类T淋巴细胞起源及胸腺器官发生
T淋巴细胞是宿主适应性免疫系统中最重要的免疫细胞之一，在抵抗病原入侵、维持机体稳态以及抗肿瘤等方面起到不可或缺的作用【1,2】。胸腺是T淋巴细胞发育的必需场所【3】。胎肝或骨髓来源的胸腺定植祖细胞（thymus seeding progenitor, TSP）迁移定植到胸腺后，即为早期胸腺祖细胞（early thymic progenitor，ETP）【4】。ETP在胸腺中经过增殖、特化、T细胞受体重排、阳性选择和阴性选择，形成成熟的胸腺细胞即初始T淋巴细胞输出至外周【5】。在该过程中，包括上皮细胞及间质细胞在内的胸腺基质细胞对于胸腺细胞的分化成熟发挥了重要作用【6】。由于技术手段制约以及样品稀缺，对于人类胚胎最早T淋巴细胞发生的认识相当匮乏。此外，精准、深入解析人类T淋巴细胞的起源及发育规律，对于指导T淋巴细胞体外再生必将提供重要的理论基础。
2019年10月8日，四川大学胡洪波研究组、解放军总医院第五医学中心刘兵研究组与暨南大学基础医学院兰雨研究组合作在Immunity杂志在线发表了题为 Single-cell RNA Sequencing Resolves Spatiotemporal Development of Pre-thymic Lymphoid Progenitors and Thymus Organogenesis in Human Embryos 的研究成果。该研究在国际上首次通过单细胞转录组测序构建了人类胚胎早期T淋巴细胞发育以及胸腺器官发生的分子图谱。
作者首先针对人类胚胎胸腺器官发生阶段（8-10周）的细胞，利用高通量单细胞转录组测序，鉴定出造血、上皮、间质、内皮共四类主要细胞群体。进一步将造血细胞分为10个亚群（图1），分别为：三个ETP亚群，包含embryonic ETP、fetal ETP1和fetal ETP2；三个T细胞前体亚群，包括 T precursor、 T precursor 1和 T precursor 2；以及固有淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞和肥大细胞亚群。通过比较embryonic ETP（主要来源于8周）和fetal ETP（主要来源于9、10周）的差异表达基因，推断在胸腺内血管形成（8周）前后【6】，造血祖细胞可能通过不同的方式迁入胸腺。通过体外培养，证实CD7+ETP（Lin-CD45+CD34+CD1a-CD7+）除了具有T细胞潜能之外，仍具有髓系、B和NK的多系分化潜能，这与成体CD7+ETP仅具有T和NK的分化潜能不同【7】。
图1. 人胚胸腺中的造血细胞群体及特征基因
为了追溯胸腺中ETP的起源，作者进一步将胸腺ETP与不同发育阶段生血位点（主动脉-性腺-中肾区）、造血位点（胎肝）和循环血中的淋系祖细胞（转录组表达IL7R的群体）进行联合分析（图2），发现ETP与相近发育阶段胎肝中淋系祖细胞最为相似。ETP可以根据与胎肝中淋系祖细胞的相似性重新分为两个亚群：更相似者具有更静息的细胞周期特征（TSP-like ETP），而另一个亚群处于更活跃的细胞周期状态（proliferating ETP）。对于胎肝而言，与TSP-like ETP在发育轨迹上重叠的那部分淋系祖细胞则被定义为TSP。胎肝中其他淋系祖细胞高表达B淋系相关基因，如CD79A, CD79B和VPREB3，提示B淋巴细胞分化潜能。既往研究表明，在早于胸腺器官发生的胚胎发育阶段，主动脉-性腺-中肾区就存在具有T淋巴细胞分化潜能的祖细胞【8,9】。本研究中，作者进一步在转录组水平实现了对于早在5周左右的主动脉-性腺-中肾区淋系祖细胞的群体捕获和分子特征分析。
图2. 转录组水平识别胸腺最早的 ETP以及胎肝TSP
此外，作者还深入分析了人胚胸腺中和 T淋巴细胞早期特化过程中的不同基因调节模式；解析了胸腺上皮细胞（Thymic epithelial cell, TEC）早期分化事件，发现皮质TEC的成熟早于髓质 TEC。为了阐明胸腺中微环境细胞成分对造血细胞的潜在调控作用，作者利用受配体分析预测了上皮、间质、内皮细胞群体与不同造血细胞群体之间潜在的相互作用；利用多色免疫荧光证实间质细胞分泌产生IGF2，可能调控表达IGF1R的造血祖细胞定向T淋巴细胞发育【10】。
综上所述，该工作精细解析了人胚胸腺器官发生阶段ETP的分子特征异质性，鉴定出最早定植胸腺的ETP及其在胎肝中的前体细胞TSP；在胸腺器官发生之前的主动脉-性腺-中肾区，实现了对淋系祖细胞在转录组水平的捕获和分析；解析了人胚胸腺中T淋巴细胞以及TEC早期分化事件；预测了T淋巴细胞发育过程中重要的异源细胞间相互作用。这些发现为人类早期T淋巴细胞发生的调节机制研究以及T淋巴细胞体外再生策略研究提供了重要的理论支撑和数据库资源（图3）。
图3. 示意图展示单细胞解析人类胚胎早期T淋巴细胞发生
据悉，胡洪波研究员、刘兵研究员和兰雨研究员为该论文的通讯作者。曾扬博士、博士研究生刘晨、公彦栋、柏志杰、侯思元为该论文的共同第一作者。解放军总医院第五医学中心妇科卞丽红主任和马春雨医生为该工作提供了大力支持。
专家点评
鲁林荣（浙江大学医学院／浙江大学爱丁堡大学联合学院）
众所周知，T细胞在人体免疫反应中起核心作用。澳大利亚WEHI Institute的生物学家Jacques Miller在1961年发现T细胞在胸腺中发育成熟，并因此在2019年分享了拉斯克基础医学研究奖【11,12】。我们对T细胞在胸腺中发育的各个阶段步骤、关键的检查点及其所需要的信号已经有了充分的研究【13】。但相比之下，我们对胸腺本身的发育及早期胸腺祖细胞的来源、特征、分类及分化过程知之甚少【14】。
此项研究，首次利用了单细胞测序方法分析了不同发育阶段人体胚胎和胎儿来源的胸腺，绘制了人体胸腺发育过程中完整的细胞图谱，阐明了早期胸腺祖细胞的多样化来源和分化途径。此项工作的主要研究发现包括：1）通过对比胸腺及胎肝和AGM区细胞，鉴定了胸腺祖细胞的两种不同来源，首次在人胚AGM区发现了一种不同类型的胸腺前淋巴祖细胞；2）明确了早期胸腺祖细胞在胸腺发育过程中由“TSP-like ETP”开始，经由具有较高增殖能力的“增殖ETP”发育到“EPT2”的发育和谱系定向途径，确定了这些细胞阶段的分子特征；3）通过基因表达指纹明确了 and T细胞分化的途径和基因表达特征；4）揭示了胸腺上皮细胞，特别是皮质胸腺上皮细胞cTEC早期发育和成熟过程，明确这些过程的分子特征，并在此基础上分析了胸腺发育过程中这些细胞与早期胸腺祖细胞间的信号互作。
我觉得这项工作的重要意义还体现在它还给胸腺T细胞发育研究带来了一些有趣的问题。譬如，胸腺发育领域内长期存在一个重要的问题：即 T和B细胞都由造血系统中淋巴细胞前体细胞发育而来，那么早期胸腺祖细胞是先得到定向T细胞发育信号来指导它们向胸腺迁移，还是淋巴细胞前体细胞随机向外迁移，并到达胸腺才确定它们的定向发育方向？之前的研究表明，ETP来源于lymphoid-primed multipotent progenitors （LMPPs），而LMPPs细胞具有向T和B细胞分化的潜能【15】。另有实验表明，胸腺ETP细胞仍具有向B细胞分化的能力，这一发现显然支持了后一种可能【16】。但此项研究表明，人胎肝存在的lymphoid progenitors可根据其分子特征，一部分细胞的分子特征与胸腺中TSP-like ETP重合，而另一部分和TSP-like ETP不重合的细胞则具有更多B细胞特征性基因。这一结果显然支持第一种可能，即胸腺前体细胞在造血器官中已经开始了向T或B细胞定向选择，定向T细胞的胸腺祖细胞才是向胸腺迁移的细胞。
这项工作还有很重要的实践指导意义：胸腺发育是人体内特化最明显的发育过程之一。迄今为止，我们还无法在体外完全重构胸腺发育和实现有功能的T细胞分化【17】。因此对人体内胸腺发育过程中细胞特性的研究，将有助于我们获得足够的相关信息，指导我们克服这一技术难题。这一难题的解决，将有望实现为免疫缺陷病人、免疫功能减退病人，和肿瘤病人重建人体免疫功能，帮助他们抵御感染性疾病和肿瘤。
专家点评
温子龙（香港科技大学生命科学部）
获得性免疫是脊椎动物进化出的复杂且独特的免疫系统，与先天免疫系统相比具有更高的特异性和更强的防御能力。T淋巴细胞作为后天免疫细胞的一种，既承担细胞免疫任务，也调控和介导体液免疫，是整个获得性免疫系统的核心成分。T淋巴细胞与多种人类疾病的产生和治疗都有密切关系，尤其是近年来，免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade）增强T细胞功能以及表达嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）的T细胞已被FDA批准用于治疗多种类型的癌症【18,19】。因此，T细胞的发育和功能一直是基础科学和临床医学研究的焦点。临床上对于T细胞的迫切需求促使众多科研团队尝试通过体外培养诱导分化的方法获得具有功能的T细胞【20-22】，然而通过体外诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）分化形成T细胞-这一最具临床应用前景的策略-目前尚未成功。对于这一难题的攻克，有赖于对胚胎时期T细胞产生、发育和分化过程更为深入的理解，这包含了两个方向的研究，其一是T细胞本身的发育，其二是T细胞发育分化所必需的器官-胸腺（Thymus）-的发生和发育。
胚胎发育早期移居至胸腺的T淋巴祖细胞（thymus seeding progenitors，TSPs）及其在胸腺内初步发育形成的早期祖细胞（early thymic progenitors, ETPs）数量极其稀少，且由于小鼠胚胎在子宫内发育，使得T细胞和胸腺的早期发育过程难以直接观察。因此，在以往通过传统技术手段开展的研究中，人们对于小鼠胚胎中TSPs、ETPs以及胸腺上皮细胞的分子特征和发育过程的理解非常有限，在人类胚胎中更是缺乏相关研究。幸运的是，近年来单细胞转录组测序技术的飞速发展，使得探索细胞群体内部的异质性和鉴定稀有细胞种类的分子特征成为可能。
解放军总医院第五医学中心刘兵课题组与暨南大学基础医学院兰雨课题组在近年来的研究工作中建立了先进的高通量测序分析技术平台，并利用此优势开展了多项胚胎造血研究，包括对于人类胚胎早期造血干细胞发生全过程的深度解析【23】等杰出工作。
近日，四川大学生物治疗国家重点实验室胡洪波课题组联合刘兵团队和兰雨团队，在针对人类胚胎时期T细胞起源和发育的研究中又做出了重大发现，三个课题组共同合作的题为 Single-Cell RNA Sequencing Resolves Spatiotemporal Development of Pre-thymic Lymphoid Progenitors and Thymus Organogenesis in Human Embryos 的文章发表在Immunity上。
他们利用10x Genomics Chromium System和 Single-Cell Tagged Reverse Transcription RNA Sequencing（STRT-seq）高通量单细胞转录组测序技术，对不同发育阶段的人类胚胎分别取样，对多个关键的造血组织进行了系统分析。他们发现人类胚胎中TSPs和ETPs在不同发育阶段具有多个不同亚群，每个亚群具有各自独特的分子特征。通过对于不同亚群的聚类分析和分子特征比对，发现在人类胚胎中，最早移居至胸腺的ETPs和胎肝中的TSPs具有相同的分子特征，提示人类胚胎早期进入胸腺的ETPs可能经历胎肝内的发育过程。他们还发现，早在胸腺开始形成之前，人胚AGM区-负责形成造血干细胞的主要组织之一-就已经出现了一批IL7R+ T淋巴祖细胞。此外，他们对TECs的分子特征进行了系统分析，发现人胚TECs包含多个不同的亚群。对不同发育阶段的TECs的基因表达水平分析发现，胸腺皮质上皮细胞抗原递呈相关基因的表达早于胸腺髓质上皮细胞的相关基因，提示人类胚胎中胸腺皮质的成熟可能早于髓质。另外，他们通过对测序细胞进行配体-受体互作分析，发现TECs可能与T淋巴祖细胞和T淋巴前体细胞之间存在多种配体-受体介导的相互作用，提示TECs可能参与调控T细胞在胸腺内的的迁移和发育过程。
他们这一研究发现与先前基于小鼠模型的多个研究结论，以及人类胚胎中的转录组测序数据高度契合，证明利用小鼠模型进行T细胞发育和胸腺发育相关研究的可靠性及其对临床医学的重要指导价值。更重要的是，他们的此项工作填补了人类胚胎中T淋巴细胞发育和胸腺器官形成在转录组水平分析的空白，其测序工作涵盖人类胚胎多个发育阶段的多个造血组织，为后续的人类T细胞相关研究提供了非常全面和宝贵的数据资料，是一个里程碑式的工作。他们获得的数据将对体外诱导T细胞分化以及相关的T细胞造血再生等医学研究领域提供重要的基础支撑。
