丙酮酸激酶的测定实验
实验方法原理
PK,ATP:丙酮酸磷酸转移酶。
有其他激酶的伴随,这个反应的直接实验:
例如,可以应用 P32 标记。由分光光度测定出,这个反应与 LDH 反应偶联,继续 NADH 的氧化反应:
实验材料 酶样品
试剂、试剂盒 三乙醇胺-HCl KOHKClMgCl2磷酸烯醇式丙酮酸ADPNADHLDH
仪器、耗材 分光光度计
实验步骤
实验所需「试剂」具体见「其他」
0.98 ml 实验混合物
0.02 ml 酶样品
25 ℃ 时,于 340 nm 处吸收值降低,ε340=6.3×103 l/(mol·cm)。
注意事项
其他
试剂:
0.1 mol/L 三乙醇胺-HCl/KOH,pH 7.6(氯化三乙醇胺,Mr=185.7;18.6 g 溶于 800 ml H2O,用 1 mol/L KOH 调至 pH 7.6,再补充到 1000 ml)
0.5 mol/L KCl(Mr=74.6;373 mg 溶于 10 ml 水中)
0.25 mol/L MgCl2(六水合物,Mr=203.3;508 mg 溶于 10 ml 水中)
0.01 mol/L 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP,三环己基铵盐,Mr=465.6;46.6 mg 溶于 10 ml 水中)
0.1 mol/L ADP(二钠盐,Mr=471.2;471 mg 溶于 10 ml 水中)
0.01 mol/L NADH(二钠盐,Mr=709.4;71 mg 溶于 10 ml 水中)
LDH (商业产品有大约 500 U/mg,准备溶液时需 150 U/0.1 ml)