DNA测序非同位素银染色法的测序反应
1. 对于每组测序反应,标记四个0.5 ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2 ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20 μl)矿物油,盖上盖子保存于冰上或4℃备用。
2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂:
(1) 样品反应:
质粒模板DNA :2.1 pmol
5×测序缓冲液 : 5 ml
引物: 4.5 pmol
无菌ddH2O 至终体积16 ml
(2)对照反应
pGEM-3Zf(+)对照DNA(4 mg) :4.0 ml
5×测序缓冲液: 5 ml
pUC/M13正向引物(4.5 pmol) :3.6 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0 ml测序级Taq DNA聚合酶(5 μ/ml)。用吸液器吸动几次混匀。
4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4 ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。
5. 在微量离心机中离心一下,使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪,以【注意】中循环模式为基准,开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。
7. 热循环程序完成后,在每个小管内加入3 μlDNA测序终止溶液,在微量离心机中略一旋转,终止反应。
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