DNA测序技术的测序反应的介绍

2022.4.06

　　1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。

　　2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂：

　　（1）样品反应：

　　质粒模板DNA 2.1pmol

　　5×测序缓冲液 5ml

　　引物4.5pmol

　　无菌ddH2O 至终体积16ml

　　（2）对照反应

　　pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg)

　　 4.0ml

　　5×测序缓冲液 5ml

　　pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml

　　无菌ddH2 O 至终体积 16 ml

　　3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。

　　4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。

　　5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。

　　6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。

　　7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。

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