免疫球蛋白纯化技术—DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白
实验方法原理 | DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH将CL-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为PH6.85~7.5),其余均属酸性蛋白。在PH7.2~7.4的环境中,酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。DEAE-sephadexA-50柱层析是离子交换层析的一种。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | 层析玻璃柱滴定铁架自由夹螺旋夹尼龙纱冰箱紫外分光光度计电导仪抽滤装置PH计透析袋座标纸滤纸PH试纸量筒烧杯试管吸管滴管灭菌小瓶 |
实验步骤 | 1. 称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5 克,悬于500 ml蒸馏水,1 小时后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5 N NaOH 15 ml的比例,将A-50浸泡于0.5 N NaOH中,搅匀,静置30 分钟,装入布氏漏斗(垫有2 层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至PH呈中性;再以0.5 N HCl同上操作过程处理,最后以0.5 N NaOH再处理一次。处理完后,将A-50浸泡于0.1 M,PH 7.4 PB中过夜。 2. 装柱 (1)将层析柱垂直固定于滴定铁架上,柱底垫一园尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
启开上口橡皮塞及下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体与柱面相切时,立即关闭出水口,以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积的2 %,蛋白浓度以<100 mg为宜)。松开出水口螺旋夹使柱面样品缓慢进入柱内,至与柱面相切时,立即关闭下口,以少量洗脱液洗柱壁2-3 次;再放开出水口,使洗液进入床柱,随后立即于柱面上加入数ml洗脱液,紧塞柱上口,使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12~14 滴/分钟。
7. 合并、浓缩
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注意事项 | 1. 柱的选择
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