免疫共沉淀与Western Blot
免疫共沉淀与Western Blot
实验步骤:
1．以60mm 细胞培养皿为例，细胞转染后24－36 小时后，吸净培养液（可用PBS
小心漂洗一次）。
2．加入500μl 预冷的1×lysis buffer, 于4℃或冰上放置裂解细胞5 分钟。
3．将细胞裂解液转移到1.5 ml eppondorf 管内，于冷冻离心机4℃，13000 g 离心30
分钟。
4．将离心后的上清液分为两份：一份35μl，加入等体积的2×SDS sample buffer, 混
匀后于100℃煮10 分钟，做为总细胞裂解液（total cell lysate，TCL）于－20℃
保存，或取6－10 μl 进行SDS－PAGE 电泳，Western blot 检测目的蛋白的表达
水平（接第5 步）。另一份用于免疫沉淀，具体操作如下：
1） 分A/G beads：按每管（一个免疫沉淀样品）加入5 μl Agrose A/G beads
及5 μl（1 μg）抗体计算一次实验所用beads 及抗体的总量，将抗体和beads 混
合，补充lysis buffer （补充的lysis buffer 的量能使每管能均匀分配到50 μl beads
及抗体的混合物），将beads 及抗体的混合物按每管50 μ（l 含5 μl beads 及5 μl 抗
体）分配到1.5 ml Eppendorf 管中，再加入400 μl 1×lysis buffer，备用；
2） 从步骤4 中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400 μl 加入到上一步（步骤
1））已分好的beads 中，使终体积达到850 μl，将管子固定到混匀器上使混匀器
匀速旋转（15 rpm）免疫沉淀3 小时；
3） 将免疫沉淀后的溶液于4℃ 3000 rpm 离心3 分钟，去上清，加入500μl
1×lysis buffer 洗涤beads，于冷冻离心机4℃ 3000 rpm 离心3 分钟，弃上清，共
洗涤三次。
4）最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩Beads，加入35 μl 1×lysis buffer 与
等体积2×SDS sample buffer 混合，于100℃煮沸10 分钟，稍离心后取10μl 左右
上样到PAGE 胶，进行电泳，或－20℃冻存。
5．电泳完毕，取下PAGE 胶，与PVDF 膜做成"三明治"形状，用湿转法进行电转1
小时。
6．电转完毕，取下PVDF 膜，加入5％脱脂奶粉，于脱色摇床摇荡（75 rpm）封闭
1 小时以消除非特异背景。
7． 封闭完毕，用TBST 洗掉牛奶，加入一抗，于脱色摇床摇荡孵育（75 rpm）1
小时，使一抗与特异蛋白结合。
8． 回收一抗，用TBST 洗3 次（75 rpm），每次5－10 分钟。
9． 加入二抗，于脱色摇床孵育1 小时，使二抗与一抗结合。
10．用TBST 洗3 次，每次5－10 分钟。
11．将ECL A 液和ECLB 液各1ml，混匀，放入二抗孵育后的PVDF 膜30 秒，将
PVDF 膜平铺于曝光盒中，进暗房，用医学X 光胶片曝光。
12．经过显影、定影后的胶片，于室温下自然风干或烘干，描画蛋白marker 便于分
析。
注：如只做Western Blot，跳过步骤4 即可。
实验试剂：
1．PBS：
NaCl 20mM, KCL 2.68mM, Na2HPO410mM, KH2PO4 1.76mM (pH7.4)，室温保
存。
2．1×lysis buffer：
Tris-HCl 20 mmol/L(pH7.5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Triton
X-100 1%, Sodium pyrophosphate 2.5 mM, β-Glycerrophosphate 1 mM, NaVO4
1 mM, Leupeptin 1 ug/ml,－20℃保存。（稀释成1×lysis buffer 后加入1 mM
PMSF ）
3．2×SDS sample buffer：
Tris-Cl（pH 6.8）125 mM，SDS 4%，甘油20%，DTT 100 mM，溴酚兰0.02%，
室温保存。
4．分离胶（下层胶）（10% SDS-PAGE）15 ml：
30% 丙烯酰胺5 ml，10×lower buffer (pH 8.8) 1.5 ml，H2O 8.5 ml，10% AP 15
μl，TEMED 15 μl。
5．10 × lower buffer (pH 8.8) 100 ml：
42.25 g Tris base，10 ml 10％SDS，室温保存。
6．压缩胶（上层胶）（4 % SDS-PAGE）5 ml：
30% 丙烯酰胺0.65 ml，4×stacking buffer (pH 6.8) 1.25 ml，H2O 3.05 ml，10%
AP 5 μl，TEMED 5 μl。
7．4 × stacking buffer (pH 6.8) 100 ml：
6.06 Tris base，4 ml 10％SDS，室温保存。
8．电泳缓冲液：
Tris base 0.125 M，甘氨酸0.96 mM，SDS 0.5%，室温保存。
9．电转缓冲液：
Tris 25 mM，甘氨酸0.2 mM，甲醇10%，室温保存。
10．10×TBS (pH 7.6)：
Tris base 2.42%，NaCl 8%，室温保存。
