临床微生物实验室在新发和再发感染性疾病中作用
编者按： 随着新发感染性疾病和再发感染性疾病的涌现，曾已被控制的感染性疾病卷土重来，临床肩负的职责和使命愈显突出。为圆满地完成使命，实验室迫切需要训练有素的微生物学专业技术人员，只有通过软、硬件两方面的建设，不断地进行自我教育，努力提高自身的专业技术水平，临床微生物室才能更好地发挥作用，不断满足临床的需要。
发表本篇综述的目的主要有两个：一是简短介绍有关新发和再发病原菌的一些信息。二是对那些可快速而准确地鉴定生物体的尖端科学技术进行回顾。
过去几年里，临床微生物工作者在快速、准确检测一系列新发和再发病原菌中的作用日渐重要。但由于实验经费的急剧紧缺以及技术的限制而使临床微生物工作的重要性得不到应有的体现。
2001年底，恐怖分子试图在美国邮件中释放炭疽芽胞杆菌，这个事件虽然非常可怕，但对于微生物工作在检测随时都可发生的再发感染性疾病中的作用产生了积极的影响并给卫生保健者和卫生保健联盟（包括医院管理者、公共卫生官员和警察）以及公众提供这样一个阴暗的但却有力的信号：无论何时，综合性的、具有尖端科技水平的现场微生物检测工作都是非常必要的。2002-2003年爆发的另一起高危的传染病严重急性呼吸道综合症（SARS）的出现，再一次证明现场诊断工作（在此指呼吸道病原菌的快速检测）的必要性。由于在疾病爆发早期并无有效的针对SARS冠状病毒的特异诊断试验，因此，排除那些可引起与SARS病毒感染临床症状相似的多数普通病毒如流感病毒就显得非常重要。
20世纪末和21世纪初生物技术的大发展极大地刺激了高度自动化的核酸检测方法的发展，这种技术能直接从病人标本中检测感染的病原体。这些方法中应用比较广泛的是实时定量PCR方法（RT-PCR）。RT-PCR可在同一系统中同时进行核酸扩增和荧光检测扩增产物。作为临床微生物实验室重要的试验平台，RT-PCR由于美国国土安全局将其作为一种快速可靠的检测潜在生物恐怖物质的测试方法而崭露头角。美国疾病预防控制中心（CDC）建立了一个包含公共卫生、部队和私立参考实验室在内的实验室反应网络系统（LRN）并将其作为参考实验室网络系统用以鉴定和确认生物恐怖物质。在很短的时间内，CDC的科学家们成功地运用一系列RT-PCR分析技术对生物恐怖物质进行检测，这些技术至今仍在LRN网络中的许多实验室中应用。
许多研究结果已经证明了这种操作简单的技术在快速（一天内）和准确检测新发和再发病原菌以及医疗实践中普通病原菌中的价值所在。从2000~2003年，共有109篇关于评价RT-PCR方法在病原菌检测和/或基因或病原菌相关耐药机制突变检测的文章发表于临床微生物学杂志（Journal of Clinical Microbiology）上。在这些文章中，84篇使用LightCycler（罗氏诊断公司，印第安纳波里，印第安纳州）；21篇使用ABI PRISM 7000、7700或7900H仪器（应用生物系统公司，福斯特市，加利福尼亚）；2篇使用SmartCycler仪器（Cepheid公司，桑尼维尔，加利福尼亚）；另外2篇则使用iCycler仪器（Bio-Rad公司，赫古斯，加利福尼亚）。与常规的染色和培养方法以及分析法相比，核酸检测技术如RT-PCR的优势在于能为各种规模的实验室提供简单易懂的可信赖的方法用于检测普通病原菌以及新发和再发病原菌。
新发和再发感染性疾病的概念
表1显示了在发达国家受到极大关注一些新发和再发人类病原菌及其相关的感染性疾病。为方便起见，仅对表1中粗体显示的病原体进行讨论。主要基于以下几个原因：第一，就目前的各种快速核酸检测技术如RT-PCR而言，并无这些病原体的快速检测方法。第二，这些病原体或其他可引起相似临床表现的病原体的快速检测是相当重要的，如果治疗不及时，这些病原体中的任何一种都能导致很高的发病率和病死率。第三，为预防疾病的播散，对症状性患者或携带者的病原体进行快速的鉴定是非常必要的。
虽然表1中的一部分病原体导致感染性疾病发生的原因仍未知，但有一点明确的是，这是由于人类的干预所导致的结果。如表中的甲氧西林（苯唑西林）耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）和万古霉素耐药肠球菌（VRE），这很可能是由于抗生素压力所造成的。以SARS冠状病毒为例，不管怎样，SARS病毒感染增加可能是人类干预的结果，如与外来动物包括携带有SARS病毒或病毒前体的果子狸接触。毫无疑问，人类干预而引发再发疾病的最直接例子就是当前美国炭疽芽孢杆菌的出现。
表1. CDC和WHO发表的在发展中国家发生的主要新发和再发感染性疾病
病原
相应疾病
炭疽杆菌…………………………………………
炭疽
伯氏疏螺旋体复合体……………………………
(伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体和埃氏疏螺旋体)
莱姆病
汉赛巴通体………………………………………
猫抓病、杆菌性血管瘤、杆菌性紫癜、心内膜炎
百日咳鲍特菌…………………………………
百日咳
埃立克体属和吞噬细胞埃立克体……………
埃立克体病
结核分枝杆菌……………………………………
结核
MRSA……………………………………………
医院和社区感染，如软组织、骨关节感染和菌血症
VRE………………………………………………
医院感染，如尿路感染、伤口感染和菌血症
病毒
流感病毒…………………………………………
流感
轮状病毒…………………………………………
腹泻
天花病毒…………………………………………
重型天花和轻型天花（天花）
西尼罗河病毒……………………………………
中枢神经系统感染
SARS冠状病毒…………………………………
SARS
a粗体显示的病原体在本文中有专门介绍
细菌所致新发和再发感染性疾病的检测
百日咳鲍特菌：革兰阴性细小球杆菌，营养要求较高，可引起危重的疾病如中枢神经系统病变，偶可导致死亡，尤其是婴儿。在一些发达国家，由于百日咳疫苗接种率的下降以及老年人疫苗接种效果的降低而导致百日咳的发病率有了实质性的升高。实验室对百日咳鲍特菌的诊断非常重要，因为这些患者可能会将百日咳传给对这种疾病非常易感的婴儿。
由于PCR检测技术的敏感性极高，PCR扩增百日咳鲍特菌基因中IS481插入序列的方法已经取代直接荧光抗体法（DFA）和普通培养法而作为检测鼻咽分泌物中上呼吸道病原体的金标准。一项研究表明，常规PCR、普通培养法和DFA检测鼻咽拭子标本中百日咳鲍特菌的敏感性分别为93.5%、52.2%和15.2%。利用荧光共振能量转移（FRET）探针和LightCycler仪器，RT-PCR法检测的灵敏度是普通培养法的2倍。图1a显示的是鲍特菌IS481/1001
ARS在罗氏LightCycler仪器上的代表性熔点曲线。
埃立克体：查菲埃立克体、艾文埃立克体和吞噬细胞埃立克体是在美国和欧洲引起埃立克体病的主要病原体；腺热埃立克体引起的感染仅限于中东地区。埃立克体引起的疾病是相当严重甚至是致命的，他们是一类细小的革兰阴性杆菌且不能用常规的实验技术进行培养。在老年患者、HIV感染者和接受免疫抑制剂治疗的患者中，埃立克体感染导致中风、呼吸衰竭和死亡的发生率要大大增加。若在外周血姬姆萨染色薄血片中感染的白细胞内，看到埃立克体桑椹样的包涵体（桑椹体），则有助于埃立克体病的辅助诊断。但确诊必须依靠埃里克体的分离培养、免疫荧光技术检测血清抗体以及PCR对血标本中埃立克体核酸的检测。埃立克体的培养需要哺乳动物细胞系，对技术要求较高，且整个培养鉴定过程至少需要1个月。而抗体的检测则需要在参考实验室才能进行，并且在急性感染期可能会出现阴性结果。一项研究结果表明，疾病发生第一周内只有22%的血清标本抗体检测结果为阳性。最近的一项应用iCyler仪器和TaqMan荧光探针技术的研究结果证明，PCR技术，尤其是RT-PCR，为快速而灵敏地检测血标本中的埃里克体属和吞噬细胞埃立克体提供了一个很好的手段。我们的研究团队已经建立了一种利用荧光共振能量转移探针和熔点曲线检测和鉴别鉴定查菲埃立克体、艾文埃立克体和吞噬细胞埃立克体的RT-PCR分析技术。与以往常规的PCR方法相比，这种技术具有更易操作、能在同一天内报告结果且有相同灵敏度的优点。
新发医院细菌性病原菌：MRSA和VRE：近年来，美国医院内MRSA和VRE感染发生率呈持续上升的趋势。由于由其所致菌血症的病死率显著高于敏感菌株如甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌和万古霉素敏感肠球菌，因此受到了特别关注。
MRSA和VRE的携带者可通过常规培养技术进行检测。但培养的灵敏度较低，尤其是粪便标本中VRE的检测，最终报告结果时间较长，这些因素都不利于快速有力地减少或消灭医院感染的发生。与培养方法相比，DNA扩增技术不仅提高了检测的灵敏度，尤其对直肠和肛周拭子标本中VRE的检测，而且也显著缩短了鼻窦拭子标本中MRSA和直肠与肛周拭子标本中VRE检测的最终报告时间。
目前，罗氏诊断公司开发了应用于LightCycler仪器可检测VRE（vanA和vanB基因检测分析）和MRSA（mecA基因检测分析）的分离式ASRs。Infectio
Diagnostic公司（IDI；Quebec，Quebec，Canada）开发的可直接筛选鼻前庭拭子标本中MRSA（SmartCycler仪器检测MRSA）的试剂盒最近得到了食品和药品管理局（FDA）的批准。我们已经应用这些技术对VRE进行了检测，结果表明，其灵敏度比标准的VRE培养筛选平板法高了至少120%，并且最终报告结果时间由普通培养的≥3天缩短为≤3.5小时。一项研究结果表明，应用IDI-MRSA和SmartCycler仪器直接从鼻前庭拭子标本中检测MRSA的灵敏度与培养相同，但报告结果则更快速（2小时之内，而培养则需48-72小时）（R.
S. Liao,D. K. Warren, L. R. Merz, and W. M. Dunne, Jr., Abstr. 43rd
Intersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother., abstr. K-1748,2003）。
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炭疽芽胞杆菌：出现以下情形应考虑炭疽芽胞杆菌的存在：临床标本直接革兰染色涂片中发现有粗大芽胞的革兰阳性杆菌或血平皿上生长有不溶血、无动力、触酶阳性的菌落。出于国家安全考虑、潜在犯罪环境下的法医学要求、当地实验室水平的安全考虑以及确证真阳性结果的必要性，任何怀疑炭疽芽胞杆菌感染的病例均要立即向公共卫生机构报告。
目前已有商业化的应用RT-PCR测试平台的炭疽芽孢杆菌试剂盒或ASRs。LightCycler炭疽芽孢杆菌检测试剂盒（Roche
Applied Science，Indianapolis，IND）和炭疽芽孢杆菌生物威胁筛选试剂盒（Idaho Technology，Salt
Lake City，Ttah）可用于LightCycler仪器上。而Artus（Hamburg
Germany）提供的RealArt炭疽芽孢杆菌PCR试剂盒可同时应用于LightCycler仪器、ABI
Prism仪器（7000，7700盒7900H）和Rotor-Gene仪器。这种PCR技术能为那些处于生物恐怖事件发生地但没有生物安全3级能力水平的实验室提供既快速、可靠的人性化、安全的检测方法。
病毒导致的新发和再发感染性疾病的检测
西尼罗河病毒：排除可治疗的病毒性中枢神经系统感染的重要性。西尼罗河病毒是一种属于黄病毒科的RNA病毒，多引起中枢神经系统感染且有很高的发病率和病死率。人类感染西尼罗河病毒的第一个病例出现于1999年夏天的美国东北部；随后这种疾病无情地从美国的东部传播到西部。而在当时，并无有效的针对这种疾病的治疗措施。 传统观点认为，在美国的夏季以及初秋，绝大多数病毒性中枢神经系统感染由肠道病毒所致。该季节时，在美国的绝大部分地区亦应考虑到西尼罗河病毒引起感染的可能。HSV在全年任何时期均可引起病毒性脑炎，而且抗病毒治疗通常有效。因此应重点排除HSV感染，尤其是诊治脑炎时。RT-PCR技术已经取代了病毒培养而作为金标准用以快速和精确地从脑脊液标本中检测HSV。如前所述，检测HSV的ASRs或试剂盒亦适用于Artus和罗氏公司的仪器。Artus也有能用于LightCycler仪器检测肠道病毒的试剂盒（AealArt肠道病毒RT-PCR试剂盒）。 |
SARS冠状病毒：与流感的区分非常重要。2002-2003年冬季SARS爆发的一个沉痛教训是：对于疾病的控制，尤其是在公共环境中，对SRARS可疑病例的患者进行早期诊断和检疫隔离非常重要。这些可控制传染性疾病的有效措施同样亦适用于控制和预防医院VRE和MRSA感染的爆发。在2003年3月上旬之前，由于病原学未明而导致在SARS爆发后的很长一段时间内并无有效的实验室方法对其进行检测。直到最后，RT-PCR测试方法建立并且至少有两家公司（应用于LightCycler仪器、ABI PRISM 7000、7700和7900H仪器以及Rotor-Gene仪器的RealArt HPA-冠状病毒 RT-PCR试剂盒[Artus]，应用于LightCycler仪器的LightCycler SARS冠状病毒[罗氏诊断公司]）使其成为商品应用于多种RT-PCR测试平台以检测SARS冠状病毒。在疾病爆发期间，排除那些可治疗的A型或B型流感病毒引起的感染相当重要，因为这些病毒感染导致的临床症状可能会干扰对SARS冠状病毒感染的诊断。
快速抗原试验检测流感病毒（A型和B型）的操作相对简单，可在局部区域检测流感病例；但这些试验敏感性较低。当A型和B型流感病毒引起的感染是可治疗时，对这些病毒的快速诊断非常重要。最近有研究表明，应用LightCycler平台的RT-PCR技术检测A型流感病毒感染的灵敏度要大大超过抗原检测法（分别是100%、44%）。
随着2002年-2003年SARS的爆发流行，许多LRN成员的实验室建立了检测SARS冠状病毒的方法。如果SARS再一次爆发流行，特别是在当地检验水平达不到检测要求的情况下，公共卫生实验室网络应能承担对感染病例进行实验诊断的重任。
结论
对于新发和再发感染性疾病，尤其是那些由于诊断的延误而将导致高发病率和高病死率的疾病，当地的临床微生物实验室在提供快速而准确的实验室诊断方面承担着不可推卸的责任。为最大程度地控制感染，快速而准确地对新发和再发感染性疾病进行诊断至关重要。而对这些病原的检测往往需要比较复杂的操作步骤，如常规PCR只能在为数不多的参考实验室和公共卫生实验室中进行。
近年来，分子诊断技术的发展催生了人性化的自动测试平台，如RT-PCR。这些新型的测试方法既能检测导致新发和再发感染性疾病的病原体，也能检测普通的病原体，在那些近距离对可疑标本进行检测的小实验室中有广泛的应用前景。
就在撰写本文期间，美国A型流感病毒（H3N2）大爆发达到了高峰，并且在远东地区新的A型流感病毒（H5N1，H9N2）毒株业已导致禽流感和人类流感的发生。由于这些新型的流感病毒株的发病率和病死率均高，因此，当地实验室具备快速而准确地鉴定流感病毒的能力极其重要。就像SARS、生物恐怖病原以及本综述中提到的其他病原体一样，快速诊断技术如RT-PCR，将在早期正确地诊断未来发生的新发和再发感染性疾病中扮演重要的角色。
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