超多重PCR技术及其在临床病原微生物检测的应用（二）
1.3 靶向-NGS（tNGS）技术的应用
超多重PCR兼具PCR对于特定微量DNA模板的特异性扩增性能以及多个片段同步扩增的能力，配合NGS测序，会拥有比普通宏基因组，全外显子组测序更为灵敏的特定基因检出率，此外前期建库流程更加简便易行并具有相当大的成本优势。目前tNGS技术的应用范围至少包括遗传疾病检测、癌症检测、人类身份鉴定和传染病检测等几个方面。
图2. 超多重PCR-NGS技术应用范围（来源：Thermo Fisher官网）
1.3.1 遗传疾病研究及相关检测
在辅助生殖领域，胚胎植入前基因筛查（PGS）可以帮助提高怀孕成功率。这一检查需要在胚胎发育的第2天或第5天检查是否发生基因组异倍体性，由于此阶段可用于检测的胚胎细胞细胞数量极少，用超多重PCR的方式进行全基因组规模的扩增会大大增加检测的敏感性和特异性。将tNGS用于新生儿进行相关检查、遗传病及携带者筛查的最大优势在于一次检出通量大于传统检测方法，同时相比于外显子组测序具有更低的价格。
在科学研究领域，tNGS方法同样具有独特的优势。2015年，协和医院发表文章利用超多重PCR-NGS技术研究限制性心心肌病（restricted cardiomyopathy, RCM）中MYBPC3基因突变与遗传性心脏病表型之间的相关性。研究人员选择具有家族世代关系的3位RCM患者以及1位零散发生RCM的不相关患者进行了原发性心肌病相关64个候选致病基因的超多重PCR，并利用NGS确认了3位家族性RCM成年患者携带相同的MYBPC3的无义突变（基因翻译提前终止导至无法生成功能性蛋白），不相关的RCM患者携带MYBP3的错义突变，并且该结果被测序的金标准Sanger测序法所证实。
1.3.2 癌症基因检测
除了对多种靶向药基因突变进行同时鉴定以指导用药之外，超多重PCR对于微量DNA信号的特异性放大能力在cfDNA检测及血液肿瘤治疗后微小残留病（MRD）的鉴定等领域都具有极大的优势。
在2019年发表的一项研究中，UCSF Benioff儿童医院的研究人员利用超多重PCR技术对青少年慢性骨髓单核细胞性白血病（JMML）的造血干细胞移植前（pre-HCT）化疗是否影响疾病的分子负担以及对造血干细胞移植后（post-HCT）效果的影响进行了研究。针对21位JMML患者，研究人员通过tNGS分别对pre-HCT化疗前后驱动基因突变的频率进行检测，发现pre-HCT化疗造成分子响应和无响应的患者其造血干细胞移植后五年无进展生存率分别为100%和61%，显示了利用tNGS进行HCT预后评估的潜在能力。
图3. 经tNGS验证对于化疗响应的患者具有更高的预后（来源：Pediatr Blood Cancer）
1.3.3 病原微生物检测
由于临床上对于常见致病微生物的种类已有相对明确的认知（~1000种），因此，针对病原微生物设计tNGS体系，以实现临床感染样本，尤其是复杂感染样本内各类病原体的灵敏性检出，是解决目前临床病原体诊断领域诸多问题的一种非常有效的手段。但针对病原微生物检测的超多重PCR体系相比于人类遗传病基因检测或癌症基因检测，需要在更小的基因组范围内考量上百甚至上千个不同种属间基因片段的特异性扩增，体系设计难度更大，故在这一领域还未出现绝对的龙头企业。但tNGS法可以优秀的性能及可接受的成本弥补现今临床多种病原检测方案的诸多缺点，应用前景值得期待。关于临床病原体检测及tNGS在其中的应用将在下文进一步介绍。
二
感染性疾病及临床病原微生物检测技术
2.1 感染性疾病概述
感染性疾病是临床常见的多发病，是全球死亡率和发病率最高的疾病之一。广义的感染性疾病包括所有病原微生物感染引起的疾病。这些病原体以病毒和细菌为代表，主要包括立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌、朊病毒、寄生虫等物质。感染性疾病广泛存在于临床各个科室中，如ICU，外科、心血管科、神经科、呼吸科、血液科、泌尿科、内分泌科、生殖科等，一直以来都是人类健康的重要威胁。
病原微生物的诊疗已成为临床医生及感染控制工作者共同关注的焦点，主要包括及时正确地进行感染源的诊断以及从抗菌谱与抗菌作用、药理特性和不良反应等方面选择合适的抗菌药物两方面。病原微生物检测可以从病原体种类、药敏以及毒力等因素评估感染情况，从而为感染性疾病的治疗及预防提供重要参考和关键依据。
2.2 病原微生物检测技术简介
病原微生物检测通常是对病人感染部位取样检查，判断菌种。常用微生物检查标本有血液、尿、痰、胸水、腹水、各种分泌物、各种穿刺液、灌洗液以及鼻咽/口咽拭子等。随着医学微生物学研究技术的不断发展，病原微生物诊断已由传统染色、培养等宏观手段发展到以DNA、RNA和蛋白为对象的分子生物技术检测方式。
2.2.1 传统检测方法
传统病原微生物的检测包括形态学检查、分离培养以及免疫学方法三类。其中形态学检查以及免疫学方法不需要进行病原体的分离培养。传统检测方法通过观察病原体本身的形态特征、测定代谢物、测定生化反应及检测病原体的抗原或抗体等手段，对菌种进行鉴定，测试其药敏特征。在一般诊疗过程中，形态学检查仅可用于初步判断病原体大类，免疫学方法的检测通量较低，而培养法是目前病原体检测中的金标准，但具有耗时较长，过程相对复杂，对操作人员的技术要求较高等缺点。
2.2.1.1形态学检查：涂片镜检
涂片精检是一种将待检样品取材、制片后在显微镜下观察、分析和判断样品中微生物种类的一种临床诊断方法，通常用于疾病的初步判断。人体的排泄物、分泌物或病患组织都可以作为检查对象。常见的涂片镜检有革兰氏染色法，可检出革兰氏阳性菌（如肺炎双球菌、炭疽杆菌）、阴性菌（如百日咳杆菌、痢疾杆菌）。经过包括初染、媒染、脱色、复染等步骤后，革兰氏阳性菌呈现紫色，革兰氏阴性菌呈现红色并且由于染色使得细菌的形态和结构特征更易于观察，从而更利于分类鉴定。此外还有抗酸染色、芽孢染色、鞭毛染色等多种染色方式。通过染色或直接观察，可根据菌体形态大致分为球菌（分散状、成堆状、链状、成双状），杆菌（长杆菌、短杆菌、链杆菌、弯曲杆菌等），弧菌等类型。
2.2.1.2免疫学检查
免疫学检测是一种基于抗原抗体特异性结合反应原理的检测方法， 将免疫反应与现代测试技术有机结合起来, 利用超微量的检测形式, 实现病原的鉴定。既可以检测病原菌的抗原，也可以检测免疫细胞的抗体。抗原检测可以确认病原菌，而抗体检测则是预防检测，健康评估的方法，两者相辅相成。临床上CRP检测即属于免疫检测的一种。免疫检测的灵敏度和特异性高，比传统的检测方法耗时减少。但病原体种类繁多，已研发的抗原、抗体数量远远不能满足市场需求，且检测结果很大程度上依赖于抗体的好坏，抗体制备、检测操作过程较繁琐，且抗体易受环境中各种物质和微生物的干扰，影响了它的广泛应用，测定成本较高。
2.2.1.3 培养法
培养法是指根据盲样检测目标、盲样性状以及染色镜检等信息，选择分离培养用培养基及增菌培养用培养基对样本中的病原微生物进一步扩增及分离培养，用以后续生化检测、鉴定病原体精确类型的方法。其具体步骤包括微生物培养及生化或其他类型的检测两部分。例如使用罗氏培养法诊断肺结核病。罗氏培养基可促进分枝杆菌的生长并抑制其他杂菌，经培养3-4周后分枝杆菌形成菌落，呈干燥颗粒状，乳白色或米黄色，形似花菜心。目前临床诊断上仍主要依赖于培养结果，但培养病原体过程耗时较长至少48～72小时，可能滞后于治疗。同时临床上常规仅能对部分细菌进行稳定培养，大多数病原微生物如肺炎链球菌等难以培养，真菌和病毒的培养往往很少使用，因此培养检测结果阳性率不高。此外采样或送检过程中引入的外界污染有可能在培养过程中被进一步放大，出现假阳性的现象。
通过培养获得浓度及纯度相对较高的病原微生物之后，生化方法通过检测微生物表达的特异性酶，对微生物种类进行鉴定。使用特定的底物，检测微生物代谢底物的能力，即可判断微生物是否具有某种特定的酶。例如检测沙门氏菌的辛酯酶法。各属肠杆菌科细菌中只有沙门氏菌表达辛酯酶，根据这一特性，甄宏太等开发了快速检测沙门氏菌的辛酯酶法。该方法是以42甲基伞形酮辛酯（MUCAP）为底物，在沙门氏菌的酶促反应后，生成4MU，在紫外灯下可观察到蓝色荧光。该方法在数分钟内即可完成，适合病菌的初步筛查。
目前临床上针对培养样本的生化检测，已有较高通量的自动生化鉴定体系建立。全自动微生物生化鉴定系统是一种集生化反应、计算机和自动化技术于一体的检测技术，具有速度快，通量高的优点。常见仪器如法国生物梅里埃公司的VITEK系统和美国BD公司的PHOENIX系统。自动化系统可进行多达几十种的微量生化反应和药敏生长试验，根据各生化反应孔中的生长变化及呈色反应情况，由计算机通过数值编码技术与数据库进行比较分析，得到鉴定结果。
