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植物水溶性总糖的提取和含量测定——蒽酮比色法

2020.9.07

一、目的：
1.掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。
2.学习植物可溶性糖的一种提取方法。
3.学习分光光度计的使用。

二、原理：
糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮(C14H10O)脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色。该物质在620 nm处有最大吸收，在150 µg/mL范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
这一方法有很高的灵敏度，糖含量在30 µg左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较适合。

三、仪器、试剂和材料
1.仪器：电子天平，超声波清洗器，电热恒温水浴锅，抽滤设备，分光光度计，容量瓶，刻度吸管等
2.试剂：
(1)葡萄糖标准液：l00 µg/mL
(2)浓硫酸
(3)蒽酮试剂：0.2 g蒽酮溶于100 mL浓 H2SO4中。当日配制使用。
3.材料：甜高粱，甘草

四、操作步骤
1.葡萄糖标准曲线的制作
取7支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液

：在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0mL，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。自水浴沸腾起计时，准确煮沸l0 min，取出，用冰浴冷却至室温，在620 nm波长下以第一管为空白，迅速测其余各管吸光值。以标准葡萄糖含量（µg）为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。
2.植物样品中可溶性糖的提取：将样品粉碎，105 ºC烘干至恒重，精确称取1~5 g，置于50mL三角瓶中，加沸水25mL，加盖，超声提取10 min，冷却后过滤（抽滤），残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤（抽滤），滤液收集在50mL容量瓶中，定容至刻度，得可溶性糖的提取液。
3.稀释：吸取提取液2mL，置于另一50mL容量瓶中，以蒸馏水定容，摇匀。
4.测定：吸取1 mL已稀释的提取液于试管中，加入4.0 mL蒽酮试剂，平行三份；空白管以等量蒸馏水替代提取液。以下操作同标准曲线制作。根据A620平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量（µg）。

五、结果处理：

其中：C——在标准曲线上查出的糖含量（µg），
V总——提取液总体积（mL），
V测——测定时取用体积（mL），
D——稀释倍数，
W——样品重量（g），
106——样品重量单位由g换算成µg的倍数

六、注意事项：
1.该显色反应非常灵敏，溶液中切勿混入纸屑及尘埃。
2.H 2SO4要用高纯度的。
3.不同糖类与蒽酮的显色有差异，稳定性也不同。加热、比色时间应严格掌握。