核酸免疫实验
介绍了用表达抗原的 DNA 增强免疫应答的途径。介绍了核酸免疫的两种方法:①注射含有 DNA 表达载体的生理盐水;② 用 基 因 枪 注 射 DNA。还包括了基因枪方法中使用的 DNA 包被金珠的制备和保存方法。
实验步骤 | 基 本 方 案 1 小 鼠 注 射 接 种DNA在免疫前应先阅读动物处理(附 录 2C) 和 接 种 的(附 录 2E) 指导说明。在正式实验之前需先进行肌肉和皮下注射练习; D N A 的精准注射对于免疫成功起关键作用。可以 用 India ink (或相同的染料)来定位注射的部位是否正确。 材料
100 mg/m l盐酸氯胺酮 20 mg/ml 盐 酸 甲 苯 噻 曉(xylazine.HCl) 合适品系的小鼠 0.5 ml或 Im l的 2 7 号 或 3 0 号针头的注射器 解剖刀,仅用于肌肉内接种(可选) 外科手术用钉或缝合线,仅用于肌肉内接种 小鼠固定板,仅 用 于皮下接种(可选) 1.在 I.5m l的微量离心管中用乙醇沉淀2 mg纯化的表达质粒DNA (单 元 10. 1 中基本方案部分,步 骤 4〜8)。用 Iml无 菌 的 0 . 9 % 的氯化钠充分溶解质粒DNA,使其终浓 度 为 2 ugDNA/Ml。 4°C短暂保存或一20°C保存几周;避免反复冻融。 2.将足量的 DNA溶 液(一般为50ul)转移至0.5m l或 Im l的带有2 7 号 或 3 0 号针头的注射器中,排去所有空气。 肌肉内接种 3a. 配 制 5m ll00 mg/m l的氯胺酮和lm l20 mg/m l的甲苯噻嗪混合液,小鼠腹腔内注射30〜40W 的 上 述 混 合 液(或 用 0 •9 % 氯 化 钠I : 1 0 稀释,注 射 300〜400M 1 ) 麻醉小鼠。将小鼠腹部朝上平躺,在大腿内侧切幵一个Icm长的切口,使其暴露出股四头肌肌肉 。 一 般来说,用外科手术暴露肌肉注射的方案增加了肌肉内注射的可靠性 4a. 在膝盖上面0.5 cm 四 头 肌 肌 肉 处 以 30°角插入针头,针头斜面 朝 上 ,针头插入约0.2 cm深 。不要刺穿肌肉。当然也可选择其他的肌肉束,如胫腓骨前侧、二头肌,以及肩胛肌肉。在 至 少 30s 内 慢 慢 注 射 50/xl DN A盐 溶 液 。切口用外科钉或缝线缝合。 另外一种可供选择的方案不需要麻醉小鼠,只需在距针头头部0. 1〜0. 2 cm制作一个颈托,这可以确保针头不会刺穿肌肉。制作这个颈托的方案是,将 IOOul枪头的尾端切下一段,然 后 将 3 0 号针头穿过枪头,枪头的宽端紧靠注射器针筒,而窄端在针头上方约9 mm处,这样就可以保证不会刺穿肌肉,使用这一装置,就可直接注射到目标肌肉里。 皮下注射 3b. 麻 醉 小 鼠(同步骤3a) 或用一个小鼠固定板。针头插入尾巴根部皮下约0.2 cm,针头斜面朝上,呈 5°〜10°角 ,几乎是与皮肤平行的方向注射。慢慢注射SOiLtl DNA盐溶液。由于溶液的注入,水泡随之涨大。越到后面,需要更大的推力注射。注射时手要保持不动,要避免刺穿皮肤或将针头拔出。 基 本 方 案 2 小 鼠 基 因 枪 接 种DNA材料压缩氦气—纯度级别>4.5 ( 9 9 . 9 9 5 % ) ; 最 大 压 力 , 2600psi(1psi =6.894 76 XIO3Pa) 合适品系的小鼠 存放包裹外源 D N A 的金粉颗粒的盒子(见辅助方案 2 ; 必须保持干燥) 基因枪和髙压氦气罐调节阀,单独购买或购买 Helios 基 因 枪 系 列(Bio-Rad) 电钳 耳 罩(如耳塞) 1 . 将压缩氦气同调节阀和基因枪连接,根据操作手册使用基因枪。 2 . 麻 醉 小 鼠(见基本方案 1,步 骤 3a; 麻醉是可选的),腹部剃毛。 3.将空弹盒装枪,开启氦气罐,戴上耳罩。将氦气压力表调至适当的压力(l Mm 金粉颗粒压力在 300〜500psi; 见 辅 助 方 案 3)。快 速 扳 动 扳 机 2 或 3 次 ,用氦气清洁基因枪。 4 . 从枪上去除空弹盒,装上包裹有外源 D N A 金粉颗粒的弹盒。
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