流式细胞仪和流式细胞术指南篇-2
核酸插入染料
溴化乙锭(EtBr)
和碘化丙啶（PI）能够结合到DNA双螺旋的大沟。4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和Hoechst染料（有几种常用的）则结合小沟。请注意，
一些染料
(例如碘化丙啶)也会结合到RNA发卡结构形成的沟中，因此如果要做DNA定量，需要用染料和RNA的混合液。其它染料，如7-AAD，不会与DNA大小
沟结合。
DNA 染料也用于细胞周期分析、染色体倍数分析和基因组大小量化。对于这些研究，通常会用到上面提到的DNA染料，但数据分析要求非常苛刻。幸运的是，有一篇很好的文章详细概述了这一过程 [10]。
细胞凋亡测定就用到了流式细胞仪的多个特性。与DNA结合而不透细胞膜的染料可用于鉴定晚期凋亡和坏死细胞。识别细胞周期蛋白（聚合酶的裂解结构和磷酸化
组蛋白H3）的抗体都可以购买到。zui早的细胞凋亡标记是磷脂酰丝氨酸（PS）溢出，它通常只在细胞质膜内膜上存在。溢出被检测到，却并非用的抗体，而是通
过一个Ca2+依赖的结合蛋白，膜联蛋白V（Annexin
V）。这一分子可以购买到，通常连接几种不同的荧光剂，它已经成为研究细胞凋亡的支柱。膜联蛋白V的详细分析请参见 [10]。
谱系染料，例如羧基二醋酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）利用膜渗透结合蛋白，然后通过琥珀酰亚胺酯与邻近蛋白作用。一旦被染色，细胞经过几次分裂后仍然是染色状态，因为跟细胞分裂消耗的时间相比，蛋白质的更新更缓慢。
阳离子和pH通道染料
钙离子(Ca2+)用Fura-2和Indo-1染料检测
[12]， 它们需要紫外线激发，因此许多流式细胞分析常用的染料在它们身上却不能使用。Magnesium Green和
一些Fura-衍生物已经被成功用到检测Mg2+上
[13]。其中有些是在可见光谱中激发的。对pH值测定的荧光染料从1979年就开始使用了。要收集实时数据，您的流式细胞仪要能显示带有时间轴的数据，收集率也必须在您想要测定的时候可以兼容多个样品。
外排染料
几种正常和转化细胞能够运输有机化合物到细胞外。当细胞发生癌变时，这是极其重要的，从细胞中移除的分子可以作为化疗药物。然而，该转运过程在正常细胞
中也能被发现，包括干细胞。一些外排的分子还具有荧光活性，有转运活性的细胞外观不同，当这些染料存在的时候，可通过流式细胞术分离。zui常用的染料是
Hoechst 33342，有转运活性的细胞被称为“侧群细胞”[14]。
细胞器染料
标记细胞器的方法有三种。首先，可以用质粒载体转染细胞，该载体上携带荧光蛋白基因，以及将蛋白质同特定细胞器分离的足够肽段信息。第二，有结合细胞器的
抗体 - 特异性标志物，但它们需要细胞有通透性。染料往往使用简单，稳定，荧光比多数荧光蛋白更明亮，一些可用于活细胞。Molecular
Probes?提供多种染料，包括产品明细一个有用 。
一些常用的染料有：用于线粒体的红色或绿色MitoTracker；用于氧化状态线粒体的Dihydrorhodamine
123；LysoTracker Green和Lysosensor Green；用于内质网的DIOC染料，以及作用于高尔基的BODIPY染料。
数据分析-软件
软件使得围绕数据分析的问题变得稍稍简单了，这也是本文这一部分要讨论的主题。然而，大多数软件以zui适合硬件的方式来匹配特定仪器的操作和数据分析。在众
多厂商里，根据收集的信息是模拟的还是数字的，数据有很大的差异。庆幸的是，有一些不错的第三方软件程序包，有一个甚至是免费的，并且他们几乎不受仪器限
制，能够开展多数想要的数据分析。
即使考虑到以上所列的困难，我们仍然不能将用这些仪器收集到的信息的广度和深度细化为生物学或医学的重要性的问题。在(
PubMed)搜索"flow cytometry" OR
"FACS"的综述文献能找到许多这一话题的文章，其中这两种方法中的一种或者两种都有所使用。表I为通过这种方式找到的应用列表。
应使用流式细胞仪或细胞分拣仪自带的软件控制仪器，除非有令人信服的理由不要使用第三方软件。通常这涉及到购买仪器制造商不再支持的用过的仪器。多数机器
特定的软件允许进行一些分析。一台双激光台式仪器可能没有边缘切割补偿、标准化和统计软件包。其次，有些软件可能有大多数功能，但缺乏一个你需要的手稿或
演示文稿。第三，可能你的合作者有一台不同的仪器，但你需要与他共享数据。zui后，你可能有数量有限的仪器软件副本，但也有许多用户想在他们自己的电脑上处
理数据，而不破坏原始数据。表III是主要的软件套装和它们应用的仪器。
首先，需要考虑仪器的类型。较旧的仪器，如BD
FACS
Calibur和FACScan，将数据处理为模拟信息。较新的仪器，如目前市场上大部分仪器，将数据处理为数字信息。模拟仪器输出是一个FCS
2.x文件，它几乎可以被任何分析软件包读取。数字数据可以导出为FCS
2.x或3.x文件，一些较旧的分析程序不能解析FCS3.0数据。一个例子是一个由Joe Trotter编写的免费软件包，可从
WinMDI下载。它可以在Windows
95和NT上运行，网上也有讨论它可能可在XP上运行。也有一个为老式Macintosh计算机上运行SoftWindows编写的In
80286版本。
不幸的是，即使两台仪器生成同样的FCS 3.0数据，却并不意味着人们可以自由地分享不同制造商仪器之间的数据。通常情况是文本格式的问题，可能有一些网上资源可以将一台仪器特定格式的文件转换 成另一台仪器的。三个仪器独立包可以自动或有小的应用程序为用户这么做。
数字数据的优势是什么？zui重要的是，每个数据点（细胞）包含相关数据，这样，如果您将数据加载到分析软件包，包括补偿在内的几乎所有参数可以修改。 FCS 2.x数据不能恢复为预补偿条件，重新分析就受到限制了。
当然也有软件包可以填补现有的分析或演示选项的缺口。其中有两个例子，BD
Biosciences的CytoPaint ( Leukobyte)和 Paint-A-Gate ，允许进行批处理聚类分析和展示/
另一个则是 Phoenix Flow Systems它在扩增和DNA分析的时候非常有用。
| 公司 | 软件 |
| 通用仪器 | |
| Cytobank | Cytobank |
| DeNovo Software | FCS Express |
| TreeStar | FlowJo |
| 特有仪器 | |
| Cell Sorters | |
| JSAN® / Bay Biosciences® | AppSan |
| BD® / FACS Calibur/Aria | Cellquest / DIVA |
| Beckman Coulter® / MoFlo® | Kaluza / Summit |
| Cytonome® | GigaSort |
| Influx / BD® | Spigot / BD FACS Software |
| Owl / Innovative Micro Technologies | To be determined |
| Partec | FloMax / CyFlow |
| Sony® / iCyt | WinList 3-D |
| Union Biometrica® | COPAS / BioSorter ? VAST |
| Flow Cytometers (analytical) | |
| Accuri®/ BD® | Cflow / BD C6 Software |
| Attune® / Life Technologies® | Attune® Software |
| Apogee | Apogee A-40 Software |
| Guava / Millipore® | GuavaSuite / InCyte |
| Gallios / Beckman Coulter® | Kaluza |
| Stratedigm | CellCap |
| Competing Technologies | |
| Amnis / Millipore | IDEAS |
| DVS Sciences®/CyTOF | 数据处理软件 |
表3。现有的流式细胞仪软件
目前，用于分析和数据共享好用的免费软件包是Cytobank，上面展示了它的细胞分拣（FACSelect）功能。对那些打算研究信号转导分子运行细
胞内流式分析的研究者来说，Cytobank能够与他们进行数据共享，FACSelect就是其中一个例子。上传的数据是保密的，可以将其标记为公开，或
只与特定的合作者共享。这样，数据可以是限制的，完全不受限制的，或限制只向同行开放。Cytobank集成了所有必备工具：补偿、限群、设置层次结构、
显示事件子集表、创建等值线图和热图、叠加直方图。图4是Cytobank数据的热图。
Cytobank确实提供了一个基于订阅的高维数据集的功能。该软件被称为 "SPADE"。
图 4. 典型的批量分析堆叠直方图
FlowJo是目前zui常用的流式细胞数据分析软件包。程序安装在个人电脑上，TreeStar可以跟随目前数据分析和演示的趋势。
FlowJo site提供了一个30天的试用版本10（苹果版是9.6）。这本手册有一个令人印象深刻的新功能列
表。不用说，建议在购买前先试用一下。图5是批处理分析产生一系列层叠直方图。流式细胞仪会快速生成大量数据。分析大量批处理样品，然后以一种有意义的方式将它们展示出来是任何流式细胞分析软件包的必备能力。
图 5. DeNovo软件得出的流式细胞分析结果
还有一个不错的选项是DeNovo
软件的FCS
Express在线数据包。一位代表堆叠柱状图产生的一个批次analysisThe的替代方案，也是一个非常不错的选择，是在网上包FCS快速从头软
件。它也有一个令人印象深刻的功能列表，并且还产生了出版物 -
Ready图形。图6示出了此分析软件包的功率，并获得的数据时，在接近瞬时的钙的细胞内的波动。请注意，X轴是时间和更迅速的细胞讯问，更有意义的数
据。它也有一个令人印象深刻的新功能列
表，也生成直接用于发表的图形。图6展示了此分析软件包的强大，对几乎瞬时的细胞内钙波动获得的数据。请注意，X轴是时间，细胞检测的越快，数据越有意义。
请注意，FCS Express已经适应了它们的图像分析软件，这一类型数据不断涌现，因此如果一个人要从仪器上生成数据，必须留心，需匹配软件的数据类型。
FCS从头分析软件
总结软件部分，流式细胞仪会产生海量的数据。
导出的FCS标准数据能够直接与不同仪器中的结果进行整合。仪器特异性的和仪器通用的分析软件包给新用户的是安全感的假象。要生成大量的数据并不难，但如
果我要试图解释这些数据，实验的、收集的和分析的变量却是无穷的。要学习如何选择正确的试剂，适当的处理细胞，设置仪器优化您的应用程序，补偿和运行恰
当的控制，阐明数据的意义，这些技能的获得都需要耗费时间。除非你不打算运行四个以上的荧光染料并且所有的染色都是在细胞表面，跟有经验的使用者紧
密合作，能避免所有自学者犯的常见错误。如果你打算做细胞分拣并希望zui后保留活细胞，这些是尤为重要的。
总结
请看表I列出的30多种流式细胞的应用。找出zui接近您的研究兴趣的一个，然后在PubMed
或谷歌学术上做快速的文献检索。确保"cytometry"为关键词。留心在zui近的几篇文章中数据的展示方式，了解试剂的数量，所用仪器的复杂性，以及数
据是如何被呈现出来的。然后回到本文中，看看我界定的新用户和有经验的用户可能会面临的所有潜在风险。对流式细胞仪的分析时间，试剂（和同种型对照，补偿
珠，以及其他试剂和缓冲液）的成本做出估计。然后根据您的特定需要对其进行修订，安排少数有经验的使用者运行程序。这是我希望给那些刚进入该领域或者将要
开展从简单分析到复杂多色实验的使用者推荐的zui低限度的准备。
