脂肪细胞的原代培养
| 实验方法原理 | 从脂肪组织中分散的细胞用25txm筛网过滤，可以排除成熟脂肪细胞，过滤下来的基质血管(stromal-vascular，SV)细胞在化学限定性无血清培养液中培养，可使前脂肪细胞得到优势生长，并逐渐积聚脂肪，发育为成熟脂肪细胞。 |
|---|---|
| 实验材料 | 雄性 Sprague-Dawley 大鼠 |
| 试剂、试剂盒 | KRBH缓冲液 KRBH-A缓冲液 DMEM-A DMEM-B 胶原蛋白酶 |
| 仪器、耗材 | Petri培养皿 锥形离心管 聚丙烯管 低密度聚丙烯瓶 尼龙滤网 尖解剖剪 Perry镊 塑料箱 铡刀 移液器 |
| 实验步骤 |
1. 主要实验材料
(1)细胞来源：4周龄雄性Wistar或其他品系大鼠。
(2)清洗液：不含Ca2+、Mg2+的PBS，加入100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素。
(3)消化液：2mg/mL胶原酶溶液，DMEM培养液配制，并加入牛血清白蛋白20mg/mL。
(4)培养液A：DMEM培养液，添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素、50μg/mL链霉素。
(5)培养液B：培养液A，添加33 μmol／L生物素、17μmol／L泛酸盐(pantothenate)。
(6)培养液C：DMEM／Ham F12(1:1，V/V)混合培养液，加人15mmol／L NaHCO3、15 mmol／L HEPES、33 μmol／L人生物素、17 μmol／L泛酸盐、100U／mL青霉素、50 μg／mL链霉素，pH 7.4。
(7)ITT培养液：培养液C，添加5 μg／mL胰岛素、10 μg／mL转铁蛋白、200 pmol／L 三碘甲腺原氨酸(T3)。
(8)筛网：孔径为25 μm的尼龙筛网。 2. 操作方法 A．取材
(1)4周龄雄性大鼠，乙醚麻醉后断头处死。 (2)无菌条件下从附睾周围切取脂肪垫，放入培养皿中，并尽量除去血管，清洗液冲洗3次。
B．分离细胞
(1)充分剪碎组织，放人消化液中，37℃水浴振荡消化40min。
(2)将消化液倒入加有培养液A的烧杯中，用吸管反复吹打，并用孔径25μm 的尼龙筛网过滤，收集滤液和未滤过的组织块。
(3)滤液1800r／rain离心5min，弃上清；加入培养液B，制成SV细胞悬液，暂存入4℃冰箱中。
(4)将未滤过的组织块重复处理一次，离心沉淀的SV细胞团用培养液B制成 SV细胞悬液。
(5)合并两次获得的SV细胞悬液，吸管吹打混匀；取少量SV细胞悬液，计数，并调节细胞密度。计数时不计入血细胞。 C．原代培养
(1)以104个/cm2的密度将细胞接种于加有培养液B的培养皿中，于37℃、5％CO2培养箱中培养12～24h。
(2)细胞贴壁后，培养液C清洗2次，后加人培养液C过渡培养1h。
(3)弃培养液C，PBS清洗2次。
(4)ITT培养液维持培养，每3天换液一次。
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| 注意事项 |
1. 脂肪细胞既可取材于附睾周围，也可从大鼠腹膜后或腹股沟部皮下取材，若在腹股沟部取材，则需清除乳房组织。 2. ITT培养液是大鼠前脂肪细胞向脂肪细胞转化的化学限定性无血清培养基，不能促使SV细胞增殖，但培养液B可以。 3. 培养液B(含血清)预培养SV细胞12～24h是为了促使细胞贴壁，若用能促进细胞黏附的生长基质成分(如纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原等)预先包被培养表面，则可不必预培养，
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| 其他 |
来源《常用医用细胞培养》
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