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用顺序浮选法快速分离血清脂蛋白

2020.7.14

用超速离心机分离血清脂蛋白,常用顺序浮选法(Sequence floating)和单次垂直管分离法(SVS),各种转速和容量都可以做,下面介绍一种简单、快捷的微量固定角式转头分离法,结果可供研究与临床分析。

 

一)设备:

● 日立CS150GXL 制备型微量超速离心机

● 转头:S140AT 固定角式转头,Nmax=140,000rpm,RCFmax=1,050,000(xg),最大容量10×2ml

● 离心管:1ml 聚碳酸脂(PC)全透明厚壁管

 

二)溶液配置:

A液:(密度=1.006克/毫升)。11.4克NaCl,0.1克EDTA-2Na置于1,000ml量筒,加500ml重蒸水及1ml 1N NaoH,充分混合直至全部溶解,加重蒸水至1,000ml,再加3ml重蒸水(NaCl含量为0.195mol)

B液:(密度=1.182克/毫升),取100ml A液,加入NaBr 24.98克(Nacl:0.195mol.,NaBr:2.44mol.

C液:(密度=1.478克/毫升),取100ml A液,加NaBr 78.32克(NaCl=0.195mol. NaBr:7.65mol.

 

三)其他:

样品:禁食后抽取的静脉血,低速离心去血球(不禁食抽取的血液中含乳麋粒-Chylomicrom第一次离心后会浮在VLDL之上)。

显色剂:脂肪红7B(FAT RED 7B),便于肉眼观察。

 

四)离心分离:

I.VLDL(密度<1.006克/毫升)分离

1 PC厚壁管,下部为血清600μl,上部为300μl A液

离心:140,000rpm,16℃,50分钟,加速“5”,减速“7”

结果:VLDL 浮在液面,有显见的一薄层

 

II.LDL(1.006克/毫升<密度<1.063克/毫升)分离

第(I)次离心后的PC管,抽去上部含VLDL的溶液300μl。抽去VLDL后,在剩余的液体(约600μl)上加入300μl溶液B,并充分混匀。

离心:140,000rpm,16℃,80分钟,加速“9”,减速“7”

结果:液面上浮着一层LDL(含有IDL)下部为HDL与血清蛋白混合液。

 

III.HDL(1.063克/毫升<密度<1.21克/毫升)分离

第(II)次离心后的PC管抽去上部含LDL的溶液300μl,抽去LDL后在剩余的液体(约600μl)中加入300μl 溶液C,充份混匀。

离心:140,000rpm,16℃,140分钟,加速“9”,减速“7”

结果:液面上浮面一层HDL,下部是血清白蛋白和球蛋白。


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