血清脂蛋白的离心分离技术
血清脂蛋白是由血液中脂质与某些特异的蛋白质组成的一类不均一的复合物。因其所含脂与载脂蛋白的比例不同，其密度范围在0.96g/ml(或更低)到1.21g/ml之间。纸电泳中显示四条带，即：乳密微粒，极低密度脂蛋白（VLDL,也称前β脂蛋白），低密度脂蛋（LDL，也称β脂蛋白），高密度脂蛋白（HDL，也称α脂蛋白）。每种脂蛋白还可以分为更多的亚组分。 用电泳法分离含载脂蛋白较高的组份（HDL，VHDL）比较成功，而离心分离法则适合用于各种密度的血清脂蛋白分离。 1梯度材料： 血清脂蛋白密度较低，常用的梯度材料为Nacl,NaI,Kbr,KI等，常用的缓冲剂为EDTA。 表一 常用梯度材料的配置及密度（20°C）
| 名称 | 配置 | 密度（g/ml） |
| Nacl | 0.196 mol/L | 1.006 |
| NaBr | 0.804 mol/L | 1.063 |
| NaBr | 2.705 mol/L | 1.21 |
| KBr | 0.747 mol/L | 1.063 |
| KBr | 1.496 mol/L | 1.21 |
| NaCl+KBr+EDTA | 153gNaCl+354gKBr+10ml 0. 2mol/L EDTA+水至总量1000ml | 1.35 |
NaCl,NaBr A液:200gNaCl+800ml水 B液:400gNaBr+600ml水 C液:11.14gNaCl+788.6ml水(ρ=1.006g/ml) | 10ml A液+31.7mlB液 10ml A液+15.6mlB液 10ml C液+2ml 1.35液4ml C液+6ml 1.35液 | 1.35 1.31 1.063 1.21 |
2预分离： 2.1血细胞与血清分离： 离心参数：全血，角转头，3000rpm×20min 结果：沉淀为血细胞，上部为血清。 2.2乳糜粒分离：禁食12小时以上人血浆中乳糜粒含量极少，已进食者因其血浆含乳糜粒高，应先离心去除乳糜粒。 离心参数：4 ×106 (g×min),10°C，各种转头转速均可。 梯度液配置：离心管下部3/4容积加血浆，上部1/4容积加0.15 mol/L NaCl+ 0.3 mol/L EDTA,pH7.4 结果：乳糜粒上浮，吸出。 2.3血清蛋白分离：除去球蛋白、白蛋白及其它蛋白质。 离心参数：（2.5-3）×106(g×hr), 各种转头均可。如角转头70000rpm× 6hrs,10℃ 配置：管容量1/3为血清，2/3为1.31g/ml,NaCl+NaBr,搅拌后终密度为1.21g/ml 结果：管上部1/6容积为血清脂蛋白，下部5/6为其他蛋白。 3方法： 3.1顺序浮选法： 3.1.1超速法：最早使用的方法，40000rpm×24hrs×3次，10℃ NaCl+NaBr梯度按1.006，1.063，1.21顺序浮选，每次在管上部取出不同密度之脂蛋白。操作简单，分辨率高，得率高，费时，成本高。 3.1.2超高速法：100000rpm×2.5hrs×2次，10℃, 100000rpm×4hrs×1次，NaCl+KBr+EDTA梯度按不含密度浮选出VLDL，LDL，HDL 3.2单次离心法： 3.2.1单次甩平分离 用最高转速为25000~28000 rpm,6×40ml甩平转头以1.006g/ml NaCl液及1.35g/ml(NaCl+KBr+EDTA)液配置成从 1.006至1.21的8层不连续阶梯度，最下部用血清与KBr配成1.25g/ml样品液，25000rpm×4hrs,4℃一次得到VLDL，LDL，HDL不同层区带。 用最高转速为40000 rpm, 6×13ml甩平转头，40000 rpm×24hrs，20℃，不连续KBr梯度1.006~1.21g/ml,细长管，分层清晰，回收率高，离心时间长 3.2.2单次垂直管分离： NaCl/KBr或NaCl/NaBr不连续梯度单管容量从5ml到40ml，转速从50000 rpm~80000 rpm，离心（0.5-3）hrs,下层用KBr或（NaBr）将血清调至1.3g/ml上层用1.006g/ml,NaCl液，10℃-20℃，增加，减速一次分出。 NaCl/蔗糖不连续梯度下层为48%W/W蔗糖,中层血清在4mol/L NaCl中，上层为0.67M NaCl+0.05% EDTA,离心参数同上，时间较长。 3.2.3区带转头大容量分离： 离心参数：区带转头，最高转速30000~48000rpm, 容量从650ml~1900ml,每次可分离血清50-150ml,低速加样及卸载，分离转速：大转头（25000-28000rpm）×2hrs，小转头（30,000-38,000rpm）×1hrs，10℃-20℃ 梯度液：(NaCl+NaBr或KBr)+EDTA不连续或线性梯度，样品在最大密度层，近转头核心处用纯水做隔离层，分离室最外部用高密度NaCl/KBr或NaCl/NaBr作缓冲层。 收集：泵出后依此经带流动地的紫外检测仪检测，自动部分收集器收集。 4讨论： 1、用以上方法分离的VLDL，LDL，MDL，还可以进一步用长离心管缩小不连续梯度密度差，分离出其亚组份。 2、实验质量很大程度上取决于密度标定，配置后可用密度剂或折射仪校核。 3、超分析超离心法可精确分离微量血清脂蛋白，并可测定各种组份（包括其亚组份）的上浮系数Sf。
