SSR及PAGE电泳-2
2、反应混合液配制
在0.5mL Eppendorf管中加入下列试剂：
稀释DNA 2 μL
primer 各0.5 μL
10×PCR Buffer 2.5 μL
dNTP 2 μL
MgCl2 1.5 μL
Taq酶 0.2 μL
加dd H20至总体积 25 μL
加完样后，加一滴石蜡油，离心混匀。放入PCR仪，盖好盖子。
3、SSR扩增程序
94℃ 3 min
94℃ 30sec
Tm ( 48-65℃) 50sec 40cycles (退火温度视引物而定)
72℃ 1 min
72℃ 7 min
反应结束后，取出10 μL左右用于电泳检测。
二、电泳检测
1、安装胶模
将准备灌胶的玻璃板、间隔片、梳子等，用去污剂洗涤，自来水冲洗，凉干，酒精檫拭。按要求组装好灌胶装置。
2、配制丙烯酰胺溶液
根据所用玻璃板的大小和间隔片的厚度，估计所需丙烯酰胺溶液的体积。不同浓度的胶各成分配比如下表(总体积100 mL)：
|
试剂 |
配制不同浓度凝胶所用试剂的体积 |
|
3.5% 5.0% 8.0% 12.0% 20.0% |
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40%丙烯酰胺(mL) |
8.7 12.5 19.9 30.0 50.0 |
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dd.H2O(mL) |
70.6 66.8 59.4 49.3 29.3 |
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5×TBE(mL) |
20 20 20 20 20 |
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10%过硫酸胺(mL) |
0.7 0.7 0.7 0.7 0.7 |
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TEMED(mL) |
35 35 35 35 35 |
3、灌胶
将配制好的溶液倒入胶模，速度均匀流畅，防止引入气泡。将玻璃板斜靠、静置，小心插入梳子，等其凝固。检查胶液是否流出。
4、丙烯酰胺的聚合
30-60分钟后，观察胶液是否聚合。聚合完后，在梳子下方可以看见折射不同的纹线。
5、拔梳子
用1×TBE浸润凝胶的顶端2-4分钟，小心拔出梳子。立即用1×TBE冲洗一下加样孔，以防止梳子所留存的少量丙烯酰胺溶液在加样孔聚合，产生不平整的表面。
6、凝胶的装载
将胶模夹在电泳槽上，胶模与电泳槽接触的边缘用热琼脂糖（50℃左右）封边。 7、加入电泳缓冲液
在电泳槽内加满1×TBE溶液。用湾头吸管或注射器排除气泡。
8、加样
用吸管吹打，使加样孔整齐划一。用小移液枪头或注射器针头加入PCR反应产物（已加过上样缓冲液）。
9、电泳
接好电极，以1-8V/cm电泳。
10、紫外检测
电泳结束后，小心取出胶板，放入0.5 mg/mL的EB溶液中，室温染色15分钟。在紫外灯下检测DNA条带。记录其多态。
结果分析
每个扩增样品会呈现若干条带，分子量大小一般为几百bp。
同一模板，不同引物扩增时，扩增结果往往不同。
同一引物，不同模板扩增时，扩增结果往往不同。
实验中要调整退火温度、模板用量、反应时间等条件，以达到最好的扩增效果。
小心使用丙烯酰胺、EB等有害物质，禁止污染。
