异源表达经验谈（3）
4. 菌种的保存、退化
一般来说是加甘油20%左右，-70保存；或制成干粉保存。但是在做甲醇酵母时发现了个问题，就是重组工程菌的退化现象比较严重，一般都是学生做得好好的，但是毕业以后下面的师弟一接手，蛋白就不表达了，或表达量非常的低。连续好几个师兄的结果都是如此，很是奇怪。我猜测可能是由于整合入基因组，毕竟是个外源的基因，不知整合到了染色体的什么部分，会不会过段时间就给“踢”下来，或就沉寂了？E.coli在复苏时都有抗性压着，酵母好像没有太合适的（不知pPICZ系列的那个抗生素好用不好用，但毕竟好贵
）。
我有个想法，是否也应像公司在做工程细胞时那样，挑个几十上百个，一起传代，10几代后仍然稳定表达的才说明基因整合到了合适的部位，不会再下来了？但是毕竟做研究生没那么多时间来干这个，否则万一不行毕业就困难了。有没有其他解决方法呢？盼高手。
5. 拷贝数对表达量的影响
对于“游离”的质粒，比如E.coli的BL21表达时，质粒的拷贝数是否对表达量有所影响？当然，由于大肠表达最主要的问题经常是表达太高了形成了包涵体，所以说白了应该希望表达量更低点的可能比较多，经常尝试各种方法（低温、低浓度IPTG等等）来降低表达量。那么BL21中的质粒是否是单拷贝的呢（没查过，不太清楚）？如果不是，能否通过降低拷贝数来降低表达量防止包涵体的形成呢？
至于酵母那种整合到基因组中的质粒，那么拷贝数是否对表达量有影响呢？通过我自己的经历，个人猜测还是有的。在上面讨论了菌种的退化问题，1年左右，重组的酵母表达蛋白就消失了。但是我曾经将这些蛋白表达消失的重组菌作了PCR鉴定，发现外源的片断仍然是存在的，就是不表达了，那么是什么原因呢？我有几种猜测：一是可能整合的位置恰好是染色体的沉寂区了，过段时间以后就沉默了，不表达了；还有一种就是会不会是原来是高拷贝的重组菌在冻存以后退化了，变成低拷贝的了（也就是可能有蛋白表达但量很低了）。当然，我后来没有作进一步的验证，比如做个杂交确证以下拷贝数到底多少，只是一种猜测。
那么，如何提高重组酵母菌的拷贝数呢？对于较早的PAO815质粒，采用的多是体外重组的方法达到高拷贝后再转化；对于pPICZ系列和pPIC9k等等则分别采用Zeocin和G418抗生素筛选的方法筛选高拷贝的质粒
