云序Mol Cancer成果教您如何写出外泌体的10分文章（二）
（2）垂死的肿瘤细胞释放的外泌体增强了ALDH1A1+ TRC的存活
作者认为肿瘤再生细胞（TRC）可能是外泌体的主要受体。由于目前没有办法鉴定TRC，因此作者收集了放射后存活的胰腺癌细胞，并通过高通量测序分析了癌症干细胞相关基因的表达谱。发现与未辐射的对照组相比，有62个基因表达被上调， 值得注意的是，辐射后ALDH1A1的表达显着上调（图2a）。众所周知，ALDH1A1是胰腺癌干样细胞重要的标志物之一。ALDEFLOUR™实验表明，放射后存活的癌细胞和原发性胰腺肿瘤细胞中ALDH
+细胞的比例显着提高（图2b-c）。qPCR分析和Western印迹表明，ALDH1A1的表达在受辐照的胰腺癌细胞和PDX肿瘤组织中表达上调（图2d）。免疫组织化学（IHC）染色进一步显示，ALDH1A1+细胞在PDX肿瘤组织中照射后高度富集（图2e）。但是，GW4869显著抑制了ALDH1A1+细胞的积累（图2e），这表明外泌体可能会促进ALDH1A1
+细胞的存活。
此外，作者检查了垂死的肿瘤细胞对TRC的直接保护作用。当与受辐照的胰腺癌细胞共培养后，受辐照的细胞表现出明显更高的存活率（图2g-h）。如图所示，辐射细胞分离的外泌体显著提高了细胞的存活率（图2h）。以上结果表明，在放疗中垂死肿瘤细胞分泌的外泌体能提高ALDH1A1+
TRC的存活率。
图2：垂死的肿瘤细胞释放外泌体增强了ALDH1A1 + TRC的存活
（3）外泌体通过促进DNA损伤反应增强TRC的存活
接着，作者探讨了垂死的肿瘤细胞分泌的外泌体如何促进ALDH1A1+细胞的存活。H＆E染色显示，PDX肿瘤中的细胞在放射后14天呈现出较大的核，并具有明显的异质性（图3a），这表明了放射损伤的积累。辐射后50天，细胞恢复了活力，并恢复了“正常”的细胞核形态。但是，GW4869处理后阻碍了肿瘤细胞的恢复（图3a）。值得注意的是，ALDH1A1+和γH2A.X双重染色表明，辐射后，ALDH1A1+细胞也遭受了DNA损伤（图3b）。在GW4869治疗组中，大多数ALDH1A1+细胞在放射后50天仍显示出明显的γH2A.X阳性灶（图3b）。这些数据表明，辐射后TRC的存活涉及DNA损伤反应（DDR），该损伤由受辐射的垂死肿瘤细胞的外泌体调节。
此外，作者还探究了外泌体是否能直接促进体外辐射存活TRC的DDR。如示踪细胞所示，辐射在ALDH1A1+和ALDH1A1-细胞中均引起DNA损伤（图3c）。GW4869显著损害了ALDH1A1+细胞的修复，因为它们中的大多数在放射后3天仍携带γH2A.X阳性灶（图3c）。此外，来自辐射的垂死肿瘤细胞的外泌体显著加速了γ-H2A.X和pATM的衰减（图3d）并降低了辐射细胞中DNA损伤（图3e）。总体而言，这些结果表明，受辐射的垂死的肿瘤细胞来源的外泌体通过促进DDR增强了TRC的存活。
图3：外泌体通过促进DDR增强TRC的存活
（4）外泌体miR-194-5p促进受损TRC的修复
作为外泌体的重要内含物，作者推断miRNAs可能在TRC的存活中起重要作用。因此，作者进行了对辐射前后的肿瘤细胞外泌体进行了外泌体miRNA测序（本实验云序提供），发现在垂死的肿瘤细胞来源的外泌体中，两个重要的miRNA，即miR-196b-5p和miR
194-5p显着上调（图4a）。前人研究表明，miR-194可能参与基因组稳定性。因此，作者将其作为目标分子，通过qPCR分析验证了miR-194-5p在外泌体中的高表达（图4b）。同样，miR-194-5p
mimics转染的细胞在辐射后具有更强大的集落形成能力（图4d）。此外，当使用强力霉素处理时，胰腺癌细胞的集落形成被显著抑制。但是，如果强力霉素诱导后的胰腺癌细胞暴露于辐射中，则这些细胞的集落形成将显著增强（图4e）。此外，miR-194-5p
mimics在辐射的胰腺癌细胞中显著促进了γH2A.X和pATM的衰减（图4f）和DNA损伤的减少。这些结果表明，外泌体miR-194-5p通过促进DDR促进了TRC的存活。
为了进一步确定miR-194-5p的主要有效靶标，作者首先预测了它的靶基因，并对预测结果进行KEGG分析，预测目标中只有转录因子E2F3与细胞周期调控有关。E2F3是E2F家族的一员，已被广泛发现可促进癌症的发生和发展。于是作者用双重荧光素酶报告基因检测证明E2F3是miR-194-5p的直接靶标（图4g）。与miR-194-5p相反，E2F3过表达促进细胞周期进程和EdU掺入，并阻碍pATM和γH2A.X的衰减（图4h）并减少受辐照的胰腺癌细胞中DNA的损伤。E2F3基因敲除提高了放射后胰腺癌细胞的集落形成能力，而miR-194-5p
mimics的转染并没有进一步增强该能力（图4i）。这些数据表明外泌体miR-194-5p抑制E2F3诱导G1 /
S阻滞并促进DNA损伤修复。
先前的研究确定HMGA2和E2F3是胰腺癌的八个主要调节枢纽中的两个， 作者发现HMGA2负调控miR-194-5p的表达（图4j），并通过一系列实验证明，HMGA2富含茎状ALDH1A1+细胞，并且有助于胰腺癌的进展。但是，当胰腺癌细胞暴露于10Gy辐射时，HMGA2的过表达显著抑制了这些细胞的集落形成能力（图4k），而敲除HMGA2则增强了细胞存活和集落形成（图4l）。HMGA2还阻碍了辐射的胰腺癌细胞中pATM和γH2A.X的衰减（图4m）和DNA损伤。总之，这些数据表明，TRC中富集的HMGA2促进了干细胞的生长和癌症进展，但潜在地损害了辐射的TRC的存活和恢复，而来自垂死的肿瘤细胞的外泌体miR-194-5p瞬时逆转了辐射下HMGA2的作用。
图4：外泌体miR-194-5p促进受损TRC的修复
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技术原理
