琼脂糖凝胶电泳之二 实验步骤及注意事项
实验步骤
一、试剂配制
1. 5×TBE缓冲液：450 mmol/L Tris-硼酸，10 mmol/L EDTA，pH值8.0。使用时将上述储存液稀释10倍至0.5×TBE缓冲液，可同时作为电泳及制胶用的缓冲液。
二、制胶
1. 根椐制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉（总液体量不宜超过锥瓶的50%
容量）。琼脂糖粉末与0.5×TBE buffer的比例（w：v）参考表1，常用琼脂糖浓度为0.7-1%。
表1 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围
| 琼脂糖浓度 | 最佳线形DNA分辨范围（bp） |
| 0.50% | 1 000～30 000 |
| 0.7% | 800～12 000 |
| 1% | 500～10 000 |
| 1.20% | 400～7 000 |
| 1.50% | 200～3 000 |
| 2% | 50～2 000 |
| 2%～5% | 20～1 000 |
2. 在锥瓶的瓶口上盖上保鲜膜或牛皮纸，并在膜或纸上扎些小孔，然后在微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时，当溶液沸腾后，请戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。此操作重复数次，直至琼脂糖完全溶解。
3. 使溶液冷却至50℃-60℃左右，如需要可在此时加入溴化乙锭溶液（终浓度0.5 μg/ml）或按照1 μL / 30 mL的比例加入DNAgreen染料，并充分混匀。
4. 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3~5 mm之间。制胶模如下图所示，小胶倒入25-30 mL左右琼脂糖溶液，大胶则60-70 mL左右，若需切胶回收，凝胶可适当加厚。
5. 在室温下使胶凝固，大约30分钟~1小时。
三、上样
1. 取适量样品与6×上样缓冲液混匀（如：1 μl样品与5 μl 6×上样缓冲液），用微量移液枪小心加入样品槽中。
2. 上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔40 μl 为上限，大孔200 μl 为上限，具体和制胶膜规格相关）。
3. 每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
四、电泳
1. 加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在110 V，电流在40 mA以上。
2. 当条带移动到距凝胶前沿约2 cm时（约40 min），停止电泳。
3. 紫外下拍照并观察。
注意事项
1. 5×TBE缓冲液放置时间过久会沉淀，因此一次性不要配太多。工作用电泳缓冲液为0.5×TBE缓冲液，取5×TBE缓冲液贮存液稀释，现配现用。
2. 用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。
3. 琼脂糖粉在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。溶解琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。
4. 凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存，一般可保存2～5天。
