质谱技术在临床诊断领域的应用趋势
质谱技术是过去几十年中受到临床实验室认可并快速发展的最新技术, 近十年来影响了医学及临床实践的诸多领域。气相色谱质谱（gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS）技术最早被应用于各类临床检测, 此后各类型质谱技术被不同应用领域所接受, 包括毒理学、微生物学、固相病理学等领域。液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）在临床检测领域具有诸多优势：可对特定物质进行精准定量, 可用于物质鉴定, 具有空间分辨模式检测能力等。当根据保留时间、相对分子质量及碎片模式分析相似化合物时, LC-MS具有较高的特异性。不同于免疫检测方法, LC-MS无需抗体, 可分析物质范围广, 高度灵活, 应用广泛。
质谱技术临床实验室应用现状
目前, 临床实验室使用的质谱技术平台大致可归入3类：三重四极杆质谱用于定量检测, 如新生儿遗传代谢病（inborn errors of metabolism, IEM）筛查、内分泌/类固醇激素检测、治疗药物监测、药物滥用检测/疼痛管理等； 飞行时间质谱（time-of-flight mass spectrometry, TOF-MS）主要应用于微生物学、蛋白组学及成像领域； 电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）主要应用于生物标志物的鉴定及半定量检测、药物滥用检测、其他“ 组学” 方面。
目前, 三重四极杆质谱定量检测在临床实验室最为常用, 且应用范围不断扩大, 检测项目亦不断增加, 如药物检测、内分泌激素检测及治疗药物监测等。特定分析物包括维生素D[1, 2]、类固醇激素[3, 4, 5]、免疫抑制药物[6, 7]及IEM相关代谢产物[8, 9]。基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI）质谱在细菌鉴定方面有出色的表现[10, 11], 而高分辨率质谱（high-resolution mass spectrometry, HRMS）的精准质量检测主要被用于蛋白组学及大部分其他“ 组学” 分析[12, 13]。ICP-MS常被用于筛查金属毒物[14, 15], LC与ICP-MS联用（LC-ICP-MS）常被用于鉴定各类含金属化合物, 包括砷、硒、汞、镉等[16]。
定量三重四级杆质谱
液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）三重四级杆定量检测是临床实验室最常采用的检测技术, 采用这一技术开展的检测项目不断增加, 围绕各类生物基质中的待检物质的研究正在展开, 不断有新的分析物及方法被报道。目前, 多数检测项目还是以多重反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）为基础加以开展。
LC-MS/MS的发展受敏感性与特异性等多种因素影响, 主要原因是现有免疫检测技术用于特定待测物质时成本过高或存在干扰物质交叉反应。免疫分析中的干扰物质主要有3类：代谢产物、结构类似物以及与目标分析物活性不同的几何异构体[17]。在美国, 当缺少经食品与药品监督管理局（food and drug administration, FDA）认证的免疫分析方法或检测性能难以满足预期时, 可选择质谱法进行检测。
当然, 质谱检测对服务于内部开发即实验室自建检测项目（laboratory developed test, LDT）的技术要求较高, 开发成熟的检测方法需采用同位素内标, 并备有证明文件。LDT也需满足由美国FDA、美国临床实验室改进修正法规（the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988, CLIA'88）、美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）、欧洲药品管理局（European Medicines Agency, EMA）及美国各州法规所发布的标准及规定。
IEM筛查
串联质谱在技术改进后被用于IEM筛查, 从而最早在临床化学领域得到认可。虽然主要采用串联四极杆质谱技术, 但大多数IEM筛查采用的质谱技术依靠流动注射技术进行半定量或定性检测, 无需进行色谱分离。如结果阳性, 则采用串联四级杆质谱仪对样本进行更严格的定量分析, 如对酰基肉碱、有机酸、氨基酸及脂肪酸氧化指标进行测定[18]。
临床毒理学
药物滥用检测与疼痛管理 药物滥用检测与疼痛管理是拓宽质谱技术应用的两大重要领域。临床毒理学充分利用了质谱平台的特异性及多重检测能力, 当免疫检测方法提示疑似某类药物时, 可采用质谱技术对个别药物是否呈阳性进行验证。该技术在美国比在中国应用更为广泛。
常见的药物滥用检测针对而不限于安非他命、脱氧麻黄碱、苯二氮卓类、丁丙诺啡、巴比妥类、可卡因、美沙酮、大麻及鸦片类药物, 多可开发为独立的检测组合, 进行定性验证或定量检测。现有定量检测多以组合形式进行, 单个组合可检测多达300种分析物。总体而言, 鉴于不同仪器制造商、仪器模式、液相色谱系统、分析柱类型的选择及医院或患者人群的特定需求, 实验室所采用的检测方法也不同。
新型合成类药物的不断出现给药物滥用检测领域带来挑战。随着新型药品的频繁上市, 需要及时开发出新的检测方法。美国仅有几家实验室具有相关资源及能力可建立针对这些“ 新型化合致幻药” 的检测方法, 可作为其他医院或社区卫生机构的参考实验室。
内分泌/类固醇激素检测
类固醇激素定量检测在内分泌疾病的诊疗中发挥着重要作用。人体内有数百种类固醇, 以四稠环体系为基础, 有相似的化学结构。尽管自动化免疫分析在类固醇检测中具有巨大优势, 但该法仍存在缺乏特异性、有基质效应及分析物动态范围有限等问题。
以睾酮为例, 相关检测对男、女性均具有重要意义, 但极富挑战。外周血睾酮水平受年龄和性别的影响, 动态范围跨度很大, 可低于0.7 ng/L, 也可高至120 ng/L。免疫检测始终在努力实现对低浓度样本的准确测量, 尤其对女性患者样本的检测, 但在内分泌及生殖系统疾病的诊断中仍然存在很多问题[19, 20]。LC-MS/MS检测睾酮具有更好的准确性及适宜的动态范围, 定量下限较免疫检测方法更低[21,22]。睾酮只是临床诊断所采用的类固醇激素指标之一, 先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia, CAH）常需要通过LC-MS/MS检测一系列类固醇后进行诊断。
LC-MS/MS除具有更好的敏感性外, 与免疫学方法单次检测仅能测定1种激素相比, 还能通过单次检测全面体现各种类固醇激素的水平。内分泌激素检测的另一个例子是维生素D, 在临床质谱领域也受到广泛关注。维生素D在美国的检测需求巨大, 串联质谱检测技术在过去几年中发展迅速, 充分反映了LC-MS/MS在临床检测中的特异性优势。维生素D是一类脂溶性类固醇激素衍生物, 在各类临床疾病中发挥重要的生物学作用, 缺乏维生素D可导致多种疾病发生。关于维生素D的生物功能及在人体中的含量对人类健康的影响尚有许多争议, 但临床诊断时普遍采用外周血25-羟基维生素D对维生素D含量进行评价, 亦常检测维生素D2和维生素D3代谢产物, 即25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3 。对儿童而言, 分离25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的3-差向异构体能帮助准确检测25-羟基维生素D。
LDT中有各类检测维生素D的方法。鉴于分析样本制备、色谱分析、电离等各检测步骤的差异, 实验室间的标准化措施极为有限。这种差异也导致不同实验室间检测结果无法互认。美国国家标准和技术研究院（the National Institute of Standards and Technology, NIST）已发布了相应标准, 与监管机构推出的室间质评计划联合致力于理顺实验室间检测结果的一致性。维生素D亦可利用免疫学方法进行检测, 有多篇文献对2种方法的性能进行了比较[23, 24, 25, 26, 27]。免疫检测方法的不足、对LC-MS/MS方法的开发需求以及开发过程中的问题, 在对维生素D的检测中均得到体现[28]。
免疫检测方法不足以区分25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3, 样本中的其他同分异构体会造成干扰, 令检测结果偏高。早期LC-MS/MS方法也无法从目标分析物中分离出维生素D的差位异构体, 同样会使检测结果偏高。因此, 对饮食中未含有大量维生素D2或未服用维生素D2药物的人群, 免疫学检测不足以对其维生素D水平进行评价。需注意的是, 关于维生素D的代谢机制仍在研究论证中, 随着新型色谱方法与同位素内标的出现, 未来临床上将会对更多异构体及/或代谢产物进行准确定量检测。
治疗药物监测
免疫抑制药物雷帕霉素问世后, 其较窄的治疗窗令移植患者药物浓度监测成为必须采取的措施[29]。随着免疫抑制药物的开发, 出现了多种药物的定量检测方法, 单次分析可同时检测他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环孢霉素A[30]。由于免疫检测方法的特异性不强, 尤其是待测物质的无活性代谢产物会对免疫检测方法产生一定的干扰[31, 32], 故多通过LC-MS/MS检测免疫抑制药物浓度。随着其他种类免疫抑制剂的出现, 还需开发相应的新方法检测其浓度。免疫抑制剂并非唯一通过LC-MS/MS进行检测的治疗药物, 还有抗抑郁药物（阿米替林）、抗癫痫药物（拉莫三嗪及左乙拉西坦）、抗真菌药（泊沙康唑）及用于监测阿片类药物依赖的丁丙诺啡, 均可通过LC-MS/MS进行检测, 从而为患者个性化治疗提供参考。
方法开发与验证
以上例子均为临床实验室广泛采用的质谱检测方法, 其中大部分检测结果直接影响到患者预后。随着这些方法被开发和利用, 对严格遵守操作程序及质量保证计划的需求愈发凸显, 室间比对的开展提升了检测质量。目前关于维生素D定量检测所开展的工作就是很好的范例。生物相关物质的定量检测领域不断被拓展, 新的药物、生物标志物、代谢产物不断扩充检测物列表, 推进了仪器的研发与分析柱及样品制备方法的改进。新方法及改进后的方法也需要经过全面验证, 以确保检测的科学性及可靠性。
TOF-MS
MALDI TOF-MS是细菌鉴定领域的新趋势。MALDI为离子源, TOF-MS为质量分析器, MALDI TOF-MS图谱就像待鉴定化合物或微生物的质量“ 指纹” 。MALDI TOF-MS的出现改变了微生物学百年来的工作模式, 其成功离不开FDA对该领域平台及应用方法的批准。
多家仪器厂商已推出MALDI TOF-MS检测系统。其周转快、成本低、鉴定诊断速度快的特点促进了患者预后的改善, 临床应用日趋增多。MALDI TOF-MS在过去的几年中日受追捧, 但在操作方面仍如同一个“ 黑匣子” 。与大多数新技术一样, MALDI TOF-MS也存在着一定的局限性, 如菌种鉴定需基于数据库匹配, 尽管大部分数据库可进行扩展, 添加本地菌种谱, 但不在库中的菌种仍无法被识别。该系统最早被用于鉴定革兰阴性菌, 对革兰阳性菌、真菌及其他微生物的鉴定功能正逐渐被开发。质谱图主要来自核糖体蛋白, 所以即便培养条件不同, 样本所提供的图谱仍会保持稳定 [10]。
ICP-MS与LC-ICP-MS
临床实验室过去主要采用ICP-MS检测血铅。该技术适用于血清、血液和尿液中的常量、微量、痕量元素分析。除血铅外, 这些检测项目需求小却会消耗大量的成本及人力, 常作为参考实验室外送检测项目。进行ICP-MS检测的商业化实验室可检测多达70种元素, 包括砷、硼、镉、铈、铬、钴、铜、铁、铅、锂、镁、锰、汞、镍、磷、铂、铼、硒、硅、银、钛、铀、锌等。
有学者尝试将LC与ICP-MS联合使用[16]。金属的化学状态（形态）对其代谢、生物利用度及毒性影响巨大, 所以单凭其总浓度也许并不能准确反映相应的危害或益处, 因此针对铂类抗肿瘤药物及含金属元素的生物分子的复合物研究也是一个热点。LC-ICP-MS一般经优化后每次检测只针对1种元素, 近期方法学的进步允许其同时检测多种元素。在研究硒对砷中毒的保护作用时, LC-ICP-MS就具有一定的优势[33]。
质谱技术的新应用
随着对质谱技术需求的增加与研究的进展, 已有许多检测项目适宜向临床推广。质谱技术在临床诊断领域的各个方面均有巨大发展, 包括针对特定蛋白质、多肽与其他“ 组学” 的定量分析、适用于越来越多临床情况及分析物的干血斑（dried blood spot, DBS）检测、MALDI病毒检测、病理解剖组织成像、试剂盒的开发、仪器的自动化与小型化、即时检验等。这些进展为质谱技术及其在临床诊断与个性化医疗中的应用不断带来更多启示与希望。
蛋白组学与其他“ 组学” 分析
甲状腺球蛋白的相对分子质量为660 000, 是LC-MS/MS用于大分子蛋白检测的范例[34], 其他蛋白及多肽检测还包括胰岛素与生长激素等。不同于小分子蛋白, 大分子蛋白检测需要采用包括蛋白消化及多肽富集在内的新方法, 以便采用质谱技术进行定量检测。如目前甲状腺球蛋白定量检测方法首先利用胰蛋白酶消化样本, 继而以免疫方法捕获, 再通过LC-MS/MS进行定量。
这些步骤在确保敏感性与准确性的同时可提升特异性, 将其省去可大大缩短分析时间、降低分析难度。质谱是蛋白组学研究的主流技术, 同时可用于包括代谢组学、脂质组学等其他“ 组学” 领域。蛋白组学着眼于器官和/或组织特异性蛋白表达, 而代谢组学则着眼于器官或组织功能, 脂质组学是代谢组学中的一个亚类, 着眼于脂质网络及通路。“ 组学” 谱通过单个研究即可提供丰富的信息, 在精准医学领域颇受重视。
DBS样本检测
DBS样本目前主要被用于IEM筛查。无论通过传统萃取法还是电喷雾电离及MALDI新技术, 利用此类样本开展各类分析均颇具潜力[35, 36]。目前, 相关研究正致力于提高DBS样本定量检测的水准, 以准确反映体液中分析物的水平, 并有望成为替代性采样手段。但是, 即便分析方法可避免检测技术现有的问题, 但DBS样本检测的固有问题并不会完全消除, 需进一步的研究和更新的技术加以解决。
成像技术
组织成像有望为固相病理学作出重大贡献[37]。质谱成像技术能够于原位对小分子药物及其代谢物、蛋白质及多肽等多种物质进行检测, 同时为传统组织学方法保留空间定位信息, 为疾病研究提供重要信息, 将在不久的未来对解剖病理学的发展产生巨大影响。目前, 供应商正致力于推出具备不同性能水平及复杂程度的检测系统。虽然围绕MALDI已进行了许多研发工作, 但新型电喷雾电离正成为另一种选择[38], 对空间分辨率的要求将影响该领域未来的发展。
MALDI
MALDI将继续进军多个临床化学领域, 在目前应用最多的细菌鉴定领域也将继续发展。现有的革兰阴性菌鉴定文库将纳入更多菌种并提升特异性, 在真菌鉴定方面也已取得了一定的进展, 并有望向其他病原微生物如病毒方面拓展。直接采集体液进行检测的技术飞跃将缩短这一进程。采用MALDI TOF-MS替代蛋白电泳检测免疫球蛋白对多发性骨髓瘤进行诊断已获得阶段性成果。除以上应用外, MALDI有望通过DBS检测协助诊断IEM及进行其他分析[36], 并通过成像技术分析发芯提示化学暴露史[39]。
试剂盒
试剂盒包含了LC-MS/MS技术检测特定物质所需的一切材料, 其实用性的增强大大推进了临床实验室对LC-MS/MS定量分析的接受度[40, 41]。这些试剂盒包含所需的分析柱、样品制备材料、校准品、质控品与软件, 甚至包含流动相和其他所需溶剂, 可减少实验室在方法开发阶段对LC-MS/MS专业人员的需求。实验室不仅要对这类试剂盒的价值进行评估, 还要对其实际易用性、可靠性及可重复性进行评价。LC-MS/MS的应用是否广泛很大程度上取决于仪器最初的调试情况, 仪器供应商正不断努力开发整体解决方案, 以增强临床实验室在资源有限的情况下对LC-MS/MS技术的适应性。
集成自动化化学分析仪
降低临床实验室LC-MS/MS应用难度的方案之一是将其整合入大型自动化分析仪, 这需要经过一系列的研发, 但其预期效果值得仪器制造厂商加大投入。利用现成的样本跟踪及处理程序可减少或解决许多临床质谱实验室所面临的问题, 如实验室信息管理系统与质谱仪之间“ 中间件” 的缺乏。此类系统方案将实现LC-MS/MS技术向现有临床分析模式的集成。
小型化及即时检验
与向自动化学分析仪集成相同, 小型质谱仪的开发给即时检测带来了希望。该技术可用于无需精确定量的筛查。小型化大气压力喷雾电离技术可用于路边药物检测以确定司机是否服用过四氢大麻酚, 也可用于学校、诊所及其他场合的手持质谱筛查仪等[42]。
总 结
在过去的10年间, 质谱技术在临床实验室的应用越来越广泛, 其具备传统方法所没有的独特优势, 包括敏感性和特异性, 特别在缺少经FDA批准的试剂盒可用时, 可满足实验室灵活开发LDT以满足患者需求。质谱技术目前已用于IEM筛查、药物滥用检测、疼痛管理、内分泌疾病诊断、治疗药物监测、细菌鉴定及痕量金属分析等多个领域。这些实验室开展的检测项目多基于三重四级杆质谱、TOF-MS及ICP-MS这3类技术平台。
质谱技术依然在蓬勃发展, 且不断深入到临床实践的各个方面, 如蛋白组学和代谢组学分析、临床实验室MALDI TOF-MS开发、病理解剖学领域的组织成像技术等。此外, 一些试剂盒也正被研发用于简化实验室的LDT。质谱仪的自动化及小型化可大大提高检测平台的实用性与灵活性。质谱技术在诊断需求方面已发挥出重要作用, 极具前景。希望通过本文能帮助读者了解质谱技术当下及未来的应用及发展, 更好地服务患者。
