辣根过氧化物酶标记试剂对果蝇类标本的染色检测
实验概要
本实验介绍了果蝇类标本的辣根过氧化物酶标记试剂染色检测操作流程。
实验原理
果蝇类标本被固定及透化处理后，可加入抗体。如同其他免疫组化技术一样可以直接用标记的一抗，或者通过标记的二级试剂(能与一抗特异性结合)进行检测。一般而言，直接标记一抗产生的信号更为清晰，背景较低。不足之处在于如检测多种抗原，就需分别制备和纯化相应的多种标记一抗。因此，除了特殊情况以外，一般推荐使用间接法，该法所需的二抗检测试剂可从商业经销处购买。
在大多数情况下推荐用酶标试剂，因其敏感度较高，使用普通的光学显微镜就可以观察结果；如需要高分辨率或同时定位2种抗原时，推荐用荧光染料标记试剂，但其检测需要使用荧光显微镜或共聚焦显微镜。
在抗原制备过程中研究者常采用几种方法固定果蝇类标本，这就使得抗原经受的处理更为强烈，通常会遇到较高背景的问题。在果蝇类标本的免疫组化染色中，为消除较高背景可将样本与正常羊血清预先孵育。大部分标记二抗试剂是羊抗鼠或羊抗兔免疫球蛋白抗体。因而，最好选用非免疫羊的天然抗体来封闭非特异交互反应性位点，从而降低背景。此外，通过降低抗体浓度并孵育过夜亦可降低背景。
酶标试剂的检测是利用可溶性的色原物质经酶促作用发生沉淀反应，在酶反应部位产生不溶性的有色物质。每种酶可利用一定范围的底物，但对于原位染色，辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)适应大多数实验的要求。HRP标记的各种试剂均可购买到。用HRP可以标记抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G、亲和素或链霉亲和素等。
HRP标记的试剂：HRP的底物包括二氨基联苯胺(DAB)、氯奈酚和胺乙基卡巴砷，但在果蝇类免疫定位中最有用的底物是DAB／金属盐。DAB也是HRP最敏感的底物之一，可产生一种高密度的棕色物质，不溶于水和醇类。在大多数情况下，建议在DAB底物溶液中加入金属离子，如加入金属盐类钴、镍等，可使其变得更加敏感，其反应产物是蓝灰色至黑色，并且在水和醇中是稳定的。DAB／金属盐类染色适合于大范围的标本检测。
主要试剂
第一抗体溶液；第二抗体(多数来自商品试剂)；PBS；含1％正常羊IgG的PBS；二氨基联苯胺(DAB)；0.05mol／LTris缓冲液(pH7.6)；0.3％(W／V)NiCl贮存液(溶于水中)；30％过氧化氢；50：50甘油：PBS混合物；70：30甘油：PBS混合物。
主要设备
解剖显微镜；光学显微镜(多数带有相机，以便于拍摄结果)。
实验材料
1．对照
特异性染色反应需要与对照进行比较。为了准确评价染色模式，应对来自同一种属的两种抗体进行比较。对于多克隆抗体来说，最好的对照是从用于制备特异性抗体的同一动物免疫前采集的血清，但亦可以使用来自相同种属动物的非免疫血清。对于单克隆抗体来说，对照应该是与特异性抗体的来源相同；例如，杂交瘤细胞培养上清对比上清，小鼠腹水对比腹水，纯化抗体对比纯化抗体。对照抗体应该与特异性抗体的类和亚类相同。来自亲代骨髓瘤的细胞培养上清不宜作为对照，因为其中不含抗体。适宜的对照杂交瘤细胞株可从美国ATCC或欧洲动物细胞培养保藏中心获得。
此外，对二级试剂应进行检测。当采用酶标染色检测时，应设立不加任何抗体的酶反应对照。这将有助于证实任何内源性酶活性的存在和分布位置。
2．准备工作
进行抗体结合和检测最重要的准备工作是进行一抗和二抗的滴度测定。虽然在下述方法中建议抗体的加入初始量，但在免疫染色中应调整一抗、二抗的用量，以便达到足以引起强大有效信号的最低浓度，以免发生非特异性染色。对每一种抗体(存在于蛋白缓冲液中，如1％IgG／PBS)做一系列稀释度并观察其对靶细胞的染色效应。1／3稀释(一份抗体中加入两份缓冲液)将接近其半对数值，并对所加入量进行合适的快速测定。对于第一抗体的每一个滴度测定应进行重复实验。而二抗一旦确定其稀释度，就可以作为该批抗体的标准用量。
如有可能，应该对携带所研究抗原基因缺失的果蝇类标本同时进行染色。这将为特异性抗体提供一个极好的遗传对照。
实验步骤
1. 样品洗毕后，悬于含1％正常羊IgG的PBS中。在1.5ml锥形管中胚胎或其他样品所占体积应少于50ul，或在5mlsnap-top管中应少于200ul。摇动孵育1h。
2. 用PBS洗2次。
3. 加一抗：用含蛋白质的溶液，如含羊IgG的PBS制备不同稀释度的抗体。单克隆抗体最好来自杂交瘤细胞培养上清(特异性抗体浓度为20-50ug／m1；以1：10稀释度作起点为佳)。小鼠腹水或纯化的单克隆抗体和多克隆抗体以及粗制的多克隆抗血清应测试一定范围内的稀释度，从而使特异性抗体浓度达到0.01-1Pg／ml。如果特异性抗体浓度是未知的，应制备并测试原始制品的不同稀释度(1：10，1：100，1：1000和1：10000)。
4. 在4℃孵育24h。
5. 用PBS洗3次，每次5min以上。PBS缓冲液中可以含1％TritonX-100或NP-40，以降低背景。
在此方法中，以未免疫的羊IgG作为封闭剂，即从正常羊血清中通过蛋白G纯化制备。因本文推荐的标记二抗是羊抗鼠(或兔)免疫球蛋白抗体，故选择羊IgG作为封闭试剂。如使用的是另一来源的标记二级试剂，则应改用其他封闭剂，如可选用3％牛血清白蛋白。
6. 加标记的二级试剂：用含蛋白质的溶液，如1％正常羊IgG／PBS制备不同稀释度的二级试剂。常用的二抗试剂包括抗免疫球蛋白抗体、蛋白A或蛋白G。一般而言，建议使用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(或兔)免疫球蛋白二抗。标记的二级试剂可以购自供应商，如使用商业来源的标记二级试剂，其稀释度可从1：50至1：1000。碱性磷酸酶标记的试剂应用Tris缓冲液稀释，而不用PBS。
7. 加标记的二抗试剂，4℃孵育1h。
8. 用PBS洗3次，每次5min以上。PBS中可以含1％TritonX-100或NP-40，降低背景。
9. 将6mgDAB溶解在9m10.05mol／LTris缓冲液中(pH7.6)。
10. 加入lml 0.3％(W／V)氯化镍贮液，也可用等量的氯化钴替代。
11. 加0.1ml 3％过氧化氢溶液(用水配制)，通常供应的过氧化氢为30％，4℃下可保存1个月左右。
12. 如果有沉淀出现，可用Whatmanl号滤纸(或相应的)过滤。
13. 将底物溶液加至样本中，孵育1-20min，用水冲洗终止反应。在显微镜下观察颜色的变化以便判断终止反应的适当时间。
14. 优化选择：在高倍镜下观察胚胎时，胚胎的直观视觉模式和通过胚胎的光路长度常引起标本出现不透明的现象。为了克服这一特点，通常用不同的试剂处理胚胎，这样将能改变胚胎的折射指数。可将胚胎在甘油或甲基水杨酸盐溶液中孵育。对于大多数染色标本以甘油效果较好。
将胚胎重悬于500ul的甘油／PBS(50：50)混合液中，于室温下孵育1h。
离心胚胎，重悬于70：30的甘油／PBS混合液中。
经过甲基水杨酸盐溶液处理的标本清晰度比甘油更好，但它易挥发，使一些工作者难于忍受这种气味。此外，它没有黏度，使得对胚胎的处理较容易。可先将胚胎通过一系列乙醇处理：50％乙醇5min，70％乙醇5min，90％乙醇5min，100％乙醇5min，各2次。再加500u1甲基水杨酸盐溶液，作用10min，不应摇动试管。胚胎将沉到底部。去除上清并加新鲜的甲基水杨酸盐溶液。最后用甘油代替甲基水杨酸盐溶液。
15. 样品观察：将用甘油洗过的样品转到玻片上。在解剖显微镜下观察胚胎，并挑选一部分在高倍镜下检查。
在一洁净的载玻片上放2张盖玻片(井1)，中间间隔lcm，以准备一个观察小室。在这间隔区加上70：30的甘油／PBS溶液。由于毛细作用就可以使该溶液进入盖玻片下。将所研究的胚胎转至该观察区，并盖上第3张盖玻片。应避免气泡的形成。来回推盖玻片，以便寻求到最佳方向进行观察。
16. 观察并照相。
