Lavision双光子显微镜-毛囊再生过程活体成像（一）
Live imaging of stem cell and progeny behaviour in physiological hair-follicle regeneration
Panteleimon Rompolas1, Elizabeth R. Deschene1*, Giovanni Zito1*, David G. Gonzalez2, Ichiko Saotome1, Ann M. Haberman2& Valentina Greco1
1Department of Genetics, Department of Dermatology, Yale Stem Cell Center, Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut 06510, USA.
2Department of Laboratory Medicine, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut 06510, USA.
摘要 组织的发生与再生依赖于细胞-细胞间相互作用和指向干细胞的信号以及它们的直接增殖。但是，引导组织适当再生的细胞行为还没有被很好的理解。运用一种新的，非侵入的双光子成像技术，我们研究了活鼠随时间推移的生理性毛囊再生。通过这种方法，我们监测了真皮层干细胞和它们的后代在生理性毛囊再生过程中的行为，并指出了间充质对它们行为的影响。承接早先的研究，干细胞在毛发再生的初始阶段处于静止状态而它们的后代处于更活跃的分生状态。除了细胞分化之外，后代细胞的协调运动也允许毛囊的快速扩张。最后，我们通过切蚀目标细胞的和长时间跟踪活毛囊展示了间充质对毛发再生的要求。因此，我们建立了一种直接原位观察毛囊内生长调控的细胞机制的方法，这使得我们可以精确调查生理性再生过程对毛囊组分的功能性要求。
材料与方法
在原位成像中，对3周龄的小鼠通过腹膜内注射克他命和甲苯噻嗪进行麻醉，头部区域的皮肤使用机械剪毛器和脱毛膏剃光。小鼠被放在一个加热平台上，头部和耳朵通过一个自制固定台固定。一个玻璃盖被放在头耳结合部的皮肤上。皮肤的图像栈通过一台装配Chameleon Vision II (Coherent)双光子激光器的LaVision TriM II Scope（LaVision Biotech产品）显微镜获取。一束激光(at 940 nm for GFP and 1040 nm for RFP, respectively)通过aX20水浸物镜（(N.A. 1.0; Olympus)聚焦并以600Hz的频率扫描0.25到0.5mm2的视野区域。系列光学切片在5分钟内以步长2-3µm成像总深度100µm的组织。从静止阶段向生长阶段转变的几个相（静止相到生长初期相）被分析。在皮肤里使用不同的内在标记以在不同试验中定位到视野的初始区域并观察同一个毛囊。实验过程中通过鼻尖吸入气化异氟醚保持麻醉状态。
三维双光子激光切蚀。使用同样的光学设备进行激光切蚀。使用900nm的激光束扫描一个10µm2的区域，以25%的激光能量持续1秒钟即可获得切蚀。根据目标深度(30–80 µm)调整切蚀参数。
主要结果
Figure 1 | 新的一次生长开始，细胞分化是在毛囊中进行空间调控的。a,静止状态毛囊。参与毛发再生的不同细胞群，包括干细胞，progeny和间充质，存在于定义的毛囊解剖隔层中。 b, 来源于双光子激光扫描显微镜系列光学切片的静止态活毛囊的三维重构。上皮细胞核（绿色）通过角蛋白14启动子(K14H2BGFP)驱动的H2B-GFP融合蛋白显影。 c, 一个progeny 分裂的例子。一个活毛囊的单独光学切片（左侧）和progeny 组分中三个处于有丝分裂期间细胞核的放大图（右侧，插图）。 d, 从几个处于早期生长阶段毛囊(n=17)中定量化细胞分裂的位置和轴 (生长初期 II)。e,垂直（左图）和水平（右图）方向干细胞分裂的两个例子。一个活毛囊的单独的光学切片（左侧插图）和处于有丝分裂中的干细胞隔层（右侧插图）的细胞核放大图。红色箭头，有丝分裂中的亲代核与子代核。图片的时间推移分别为15分钟和45分钟。标尺20 µm.
