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LaVision双光子显微镜-多线扫描双光子成像（一）

2020.6.29

Journal of Neuroscience Methods 151 (2006) 276–286

Application of multiline two-photon microscopy to functional in vivo imaging

Rafael Kurtz a,∗, Matthias Fricke b,1, Julia Kalb a,2,

Philip Tinnefeld b,3, Markus Sauer b,4

a Lehrstuhl f¨ur Neurobiologie, Universit¨at Bielefeld, Postfach 100131, D-33501 Bielefeld, Germany

b Lehrstuhl f¨ur Angewandte Laserphysik und Laserspektroskopie, Universit¨at Bielefeld,

Postfach 100131, D-33501 Bielefeld, Germany

Received 3 November 2005; received in revised form 28 November 2005; accepted 4 December 2005

摘要

高空间分辨率和低的光损伤风险使得双光子激光扫描显微镜TPLSM成为生物功能成像的选择。但是，如神经钙离子调控等功能性动态研究通常也需要一个高的时间分辨率。目前，通过线扫描可以获取速度的提升，但是将结构的空间分辨率限制在一条轴上。为克服高空间分辨率和高时间分辨率间的空白，我们改进了TPLSM，使用一个多倍分光器来在样品中产生多个激光焦点。通过使用一个电子倍增相机检测这些焦点释放的荧光，它可以支持同时进行多条线扫描。除了多线扫描，高达64束的阵列也允许使用X-Y扫描模式去以高的帧速获取整幅图像。为估测多线扫描TPLSM在功能性原位成像中的应用，监测了苍蝇大脑中的视觉运动神经元中的钙离子信号。以分枝状轴突和棘突状结构的测量为例展示了我们的方法对于从不同细胞位置同时获取信号的能力。钙离子动态依赖于分支大小，但是“棘突”与他们的“母轴突”并没有系统性的区别。我们设备的空间分辨率与激光共聚焦显微镜进行了严格比较并通过运行成像和点扫描模式直接评估图像检测过程中释放光散射的负面效应。

Keywords: Two-photon; Microscopy; Calcium imaging; Temporal resolution; Beamsplitter; Visual system; Invertebrate

1.导论

调查单个神经细胞和神经回路内的动态过程通常要求对神经活动具有高时间分辨率和空间分辨率的成像。传统宽视野荧光显微镜对完整组织的空间分辨率受到光散射的严重影响。另一方面，时间分辨率受到CCD在弱光条件下获取图像所需时间的限制。

激光扫描显微镜尤其是TPLSM，在散射性组织中可能提供了比传统成像方式更高的空间分辨率，并允许基于不同焦平面的图像系列的三维重构(for review see: Halbhuber and K¨onig, 2003; Helmchen and Denk, 2002; Wright and Wright, 2002; Zipfel et al., 2003).激光扫描显微镜的更高的空间分辨率事实上取决于受到样品内激光焦点限制的信号检测（共聚焦显微镜）或激发本身（TPLSM）。

但是，成像速率是激光显微镜中的一个问题：例如，当激光沿着一个轴重复扫描时，只有在线扫描中，获取率通常可以上升到每秒几百个样品。相对而言，扫描整幅图像或者在Z平面进行图像堆栈与传统宽视场荧光成像同样耗费时间。当在不能用单条线扫描完全涵盖的多个神经结构功能性信号比较时，它存在很大的问题。不幸的是非同时性的多个线位置连续数据收集通常不是一个能说明问题的选择，因为在实验间变异性很大的神经元响应中它得出的结论太间接。(see e.g. Passaglia and Troy, 2004; Warzecha and Egelhaaf,1999). 在获取整幅图像时提高时间分辨率的技术，例如转盘共聚焦显微镜，虽然有新的发展，在活样品的致密组织应用中获得的信号过于微弱。 (see e.g. Coates et al., 2004; Nakano, 2002).

在这个研究中，我们调查了是否多线TPLSM能够帮助克服在功能性成像中时间分辨率和空间分辨率间的权衡。

多线TPLSM的原理以基于镜面的光束分光器为基础，它可以把一束激光分解成多束(Nielsen et al., 2001).在TPLSM中，激发内在性限定在激光很小的焦点处，这个分光器可以在样品的焦平面上产生多个这种激发点。我们证明这种多焦点模式可以有效地用于同时执行多个线扫描。而且，使用多激光焦点扫描时图像的获取速度会提高，因为每条光线只扫描图像的一部分，或者每个样品点被多条光束成功激发。近来，一个相似的光束分光器设计已经被提议用到荧光寿命成像上。 (Leveque-Fort et al., 2004).

对正常动物的成像是功能性成像最具挑战性的工作 (for review see: Helmchen andWaters, 2002).我们使用苍蝇视觉系统的神经元钙离子动态监测作为多线TPLSM的关键测试。Blowfly大脑中的视觉运动处理区域，小叶板，包含了60个大的可独立识别的方向选择性神经元，所谓的切向细胞TC。(for reviews see Borst and Haag, 2002; Egelhaaf and Borst, 1993; Egelhaaf et al., 1988, 2002, 2005). 这些神经元已经成为研究近乎自然状况下神经信息处理的唯一模型系统。在电生理学与光学记录实验中，TC表现出作为运动感受器的功能，每一个神经元被以一种特殊的方式裁剪以适应来自移动中眼睛产生的动态模式的光流信息的精确明显的组分(D¨urr et al., 2001; Egelhaaf et al., 1993; Krapp and Hengstenberg, 1996; Single and Borst, 1998). 由于来自外周局部动作敏感神经元的神经信号的视网膜拓扑取样TC具有大的感受域。而且，TC间的相互作用大大增加了感受野的大小和动作特异性(Haag and Borst, 2001; Horstmann et al., 2000).

使用钙离子成像作为TC局部树突活化的标记(Borst and Egelhaaf, 1992; D¨urr and Egelhaaf, 1999; Haag et al., 2004; Single and Borst, 1998). 而且，有证据表明树突钙离子的增加卷入了活性依赖的动作灵敏度度的调控，如动作调整 (Kurtz et al., 2000). 突触钙离子浓度改变的成像已经被用于描绘感受刺激中的分级突触传递的特点。(Kurtz et al., 2001). 在所有这种组织中，更高空间和时间分辨率的钙离子成像将帮助我们得出更直接的结论，例如树突输入整合，突触传导中的钙离子动态调控和通过钙离子的动作调节的潜在时空控制。

除了它的优越性能和在致密组织的深层激发过程中降低的光损伤之外，由于使用近红外波段激发，也避免了光感受器的视觉激发，TPLSM成为原位成像中的一种方法选择，尤其适用于视觉系统。(see e.g. Denk and Detwiler, 1999; Euler et al., 2002). 通常，共聚焦和传统成像通常伴随着不需要的视觉激发，因为荧光染料的单光子激发光谱与光感受器的感受范围存在很大的重叠。苍蝇的视觉系统首次被用来通过单线扫描和一个雪崩二极管监测钙离子信号来检验原位TPLSM成像(Kalb et al., 2004). 之后，Haag et al. (2004) 分析了条纹模式的动作中TC中的局部树突钙离子震动，以得出TC的局部动作检测器输入的计算模式。在后者的研究中，获得了64×64像素的图像，但是钙离子成像的时间分辨率只有8Hz。相对的, Kalb et al.(2004) 获得了高达400Hz时间分辨率的单线扫描图像，空间分辨率限制在10um的一条线。当前的研究首次表明TPLSM中的多线原理可以被如何有效地应用以弥补神经活动功能成像中时间分辨率与空间分辨率之间的空白。

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LaVision双光子显微镜-多线扫描双光子成像（一）

周锦帆