密切结合临床，提高真菌学检验水平
当前,病原微生物感染性疾病给人类带来的危害有增无减,其中由真菌引起的感染也因免疫受损宿主的不断增多而日渐突出。国内近年来机会性真菌感染的患病率和病死率呈急剧上升趋势,但临床上真菌感染诊断的现状却远远不能满足需要,特别是早期特异诊断一直存在困难,因而使很多患者病情延误导致治疗失败甚或失去了治疗的机会。因此,如何提高真菌病的诊断水平已成为国内外临床工作者们共同关心的热点问题,临床实验室在真菌病的诊断和治疗中发挥着越来越重要的作用。本期旨在唤起大家对医学真菌临床检验工作的重视,交流国内外在该领域的研究进展,使大家看到方向、增强信心、促进交流、扎实工作,努力提高我国医学真菌临床检验水平。笔者认为,目前临床真菌实验室应密切结合临床,扎扎实实做好真菌的常规检验;二是积极开创真菌检验新方法。
一、重视真菌的基础检验,监测真菌感染的流行趋势
1. 真菌感染的流行趋势:据国外资料报道,器官移植受者和恶性肿瘤患者中真菌感染的患病率高达20 %～40 % ,而且往往是致命的感染。真菌感染已成为艾滋病患者的主要死亡原因。国内近十年来,机会性真菌感染同样呈现出明显的上升趋势,其中念珠菌感染高居首位,占血源感染的第4～5 位;侵袭性曲霉感染已成为在器官移植患者特别是骨髓移植患者常见的合并症;隐球菌性脑膜炎在我国非HIV 感染人群中也不少见;在重症糖尿病和器官移植等患者中,毛霉菌(接合菌) 和镰刀菌的感染常可危及患者生命。但是有关真菌感染的流行情况以及各种高危人群中的具体发病情况仍然缺乏确切的资料。
目前亟待解决的问题是: (1) 我国深部真菌病的流行情况及致病菌种流行趋势和变迁规律; (2) 条件致病真菌在各种高危人群中的分布规律及真菌感染前瞻性患病率调查; (3) 我国首先发现或我国多发的病原真菌的生物学特性;这些问题的解决对于制定我国真菌病防治的策略十分重要。要了解这些问题,特别要强调临床与实验室之间的密切配合。总结我国条件致病性深部真菌感染发病的总体情况以及在高危人群中的分布规律,了解病原菌与不同危险因素之间的关系。
在真菌感染的流行病学方面,已发展出一些切实可行的分子生物学方法来区别一些特殊菌株,用于菌株分型、鉴定并研究其亲缘关系。这些技术主要包括聚合酶链反应(PCR) 派生出的一系列菌株分型技术,如随机扩增多态性DNA(RAPD) 、限制性片段长度多态性分析(RFLP) 、单链构象多态性分析(SSCP) 、脉冲场凝胶电泳(PFGE) 和DNA 序列分析等。利用这些手段,可以了解暴发性真菌感染的分子流行病学,了解感染来源,判断复发和再感染。目前国内已有较多这方面的工作,关键是能够切实应用到临床实际工作中。
2. 重视真菌基本检查技术:直接镜检法和培养检查法是形态学检查的基本方法。直接镜检法简便、快速、实用。阳性结果可确定真菌感染。但阳性率较低,阴性结果不能排除诊断,与培养检查结合才能更好地为临床服务。如在无菌体液的直接镜检中发现真菌成分常可确立深部真菌病的诊断。但在有菌部位则只有发现大量真菌菌丝才具有诊断意义,有经验的检验师通过直接镜检一般可以区分念珠菌、隐球菌、毛霉菌等真菌的感染。培养检查法的目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率,验证直接镜检的结果,同时确定致病菌的种类,有条件可以进一步进行体外药敏试验。培养时间一般为4 周,个别生长缓慢的菌则需更久,切不可过早弃去造成假阴性结果。培养菌株,应尽可能鉴定到种,这对于收集病原学完整资料非常必要。目前酵母菌的鉴定体系比较规范,如采用API 20C 和全自动微生物鉴定体系等。值得指出的是,一些显色培养基往往对白念珠菌和几种常见的念珠菌鉴定比较可靠,而对其他少见菌种则要靠几种方法互相验证,不能仅依据颜色变化来判定。对丝状菌(霉菌) 的鉴定则需要经验的积累、查阅大量文献和专业书籍,按照各类菌所需要的规范方法,对菌落的特性观察和显微镜下产孢特点等进行详细观察,有时需要数周的时间重复多次接种才能得出正确结果。
一个有经验的真菌检查室除向临床报告对分离菌的鉴定结果外,同时应将该菌在临床上的意义予以说明。一般来说,一旦培养出肯定的致病菌如新生隐球菌或组织胞浆菌时,可确立感染的存在。但如果分离出条件致病菌如白念珠菌或烟曲霉菌时,则应结合临床情况进行判断。从无菌部位如血液或脑脊液中分离出条件致病菌常提示肯定的感染,但对来自于脓、痰或尿的标本则应谨慎解释结果,单靠一次培养阳性往往不能确定诊断,需重复3 次以上,有时还需结合直接镜检的结果,因此,应强调直接镜检与培养检查相结合的重要性。鉴于目前条件致病性真菌感染不断增加的现状,难以排除少见真菌引起感染的可能性。因此,在没有经过认真分析之前,任何一株培养物都不应被视为污染菌。强调临床医师与实验室检验人员之间应保持密切联系。
由于临床上对真菌感染的重视,对真菌病原体的检出率不断提高,其中包括不少严重的侵袭性或播散性感染。一些国内过去少有报道的真菌感染也在增加,如接合菌中的毛霉菌、根霉菌、根毛霉菌引起的局部和系统感染;镰刀菌、枝顶孢霉引起的感染等,还有不少国内首报、世界罕见的感染。这些新致病菌种的发现和正确鉴定均得益于基础真菌学检测手段的正确运用。我国真菌资源丰富,但临床发现的新致病菌种类还不够多,其原因在于不够重视基础真菌学检验,如不能将直接镜检与真菌培养方法联合应用;过分依赖培养结果(实际在有菌部位其意义有限) ,忽略了直接镜检的阳性发现才是病原真菌入侵机体的直接证据;不注重寻找组织学证据这一诊断的“金标准”等。在对培养物的鉴定方面,也存在不够规范的问题,临床与实验室之间、实验室与实验室之间缺乏交流,对结果难以作出正确判断。很多实验程序不够统一,缺乏质量控制和标准化。甚至有轻视形态学、片面追求一些不切实际的“新技术”,不愿做深入细致的形态学观察的倾向,这些问题如果不加以改进,势必将限制我国临床真菌学的发展。对真菌基因结构信息的不断了解为确切鉴定致病真菌提供了方便。在2003 年5 月召开的第15 届国际人和动物真菌学大会上,采用PCR 对未知菌株的靶基因进行扩增、测序并在网上数据库中进行搜索比对(通常在数秒钟内完成) ,已成为普遍接受的对难鉴定菌的一种新的替代方法,采用这种方法还是要有形态学基础,而且对靶序列的选取也很重要。
二、深入研究病原真菌生物学特性,探索真菌感染诊断新方法
在真菌感染中,深部真菌感染危害最大,它的诊断困难、进展迅速、顽固难治、病死率高。如念珠菌血症,若不治疗死亡率可以达到45 %～76 % ,侵袭性曲霉病死亡率高达55 %～70 %。传统的形态学诊断方法存在敏感性低、耗时久的缺陷。因此,引起国内外同行们注意的另一方面问题就是真菌感染非传统方法的探讨和应用,目前的进展主要是真菌抗原和代谢物的检查,PCR 扩增等技术。笔者认为,对于这些新方法还有待在临床充分验证,一般应在以下几方面进行评价:了解其在不同疾病的不同阶段的敏感性和特异性;是否较其他的检查方法更为早期和特异地作出诊断;是否存在对敏感性的干扰因素;是否可以区别菌落定植和疾病状态;是否可以用来监测疗效、监测复发和估计预后;是否为种特异性等。
抗原和真菌代谢物的检测,尤其适用于免疫低下宿主真菌感染的检测。其中最成熟的当属检测新生隐球菌荚膜抗原的乳胶凝集试验。文献报道用酶联免疫吸附试验( ELISA) 检测念珠菌甘露聚糖敏感性6413%,特异性9712%。曲霉菌半乳甘露糖抗原的ELISA 的敏感性在50 %～90 %之间,还有对检测真菌葡聚糖的方法,这些方法国内临床上已有应用,但应不断积累经验并与影像学和临床、真菌学结果一起进行判断。
目前已制备出针对人类主要病原真菌结构的单克隆抗体,其诞生已给真菌感染的诊断带来了明显的进步;改进了对免疫低下病人体内循环抗原的检测。单克隆为基础的血清学试验,也已上市用于深部真菌病念珠菌病、曲霉菌病和隐球菌病的诊断,但目前在国内尚未普遍应用。
分子生物学技术的飞速发展,对于真菌病的诊断起到了强有力的促进作用,特别是以PCR 技术为代表的一类方法,为快速、敏感、特异诊断侵袭性真菌感染如念珠菌病和曲霉菌病开辟了新的诊断途径。目前方便的网上资源可供我们进行序列分析比较,据此设计出引物或探针。目前在国内,真菌通用及种、属特异性引物已初步应用于PCR 技术对系统性念珠菌病、隐球菌病和曲霉菌病的早期特异诊断,包括一步PCR 和巢式PCR 等方法。实时PCR 应用于真菌感染诊断将大大提高真菌感染诊断方法的敏感性和特异性。这些新技术的成功应用,对于提高难以诊断的深部真菌病的诊断水平有十分重要的意义,但如何应用于临床对血液、尿液和脑脊液等标本进行检测尚有待探讨。关键问题是PCR 方法的标准化和规范化。
三、建立规范化的体外药敏试验方法,有效指导临床治疗
随着真菌感染的不断增多,临床抗真菌治疗领域也发生了许多令人瞩目的变化,新的抗真菌药物还在不断涌现。体外药敏试验是重要的疗效监测手段,无论对于药物的选择还是对监测耐药株的出现均有重要意义。随着抗真菌药物的广泛应用,真菌耐药现象的报道也逐渐增多。我国临床分离的念珠菌对唑类药物的耐药现象也日渐突出,此外,曲霉菌等丝状真菌的耐药问题也令人担忧,临床常用的几种抗真菌药物都存在程度不等的耐药问题。
针对这种现状,建议在临床常规开展体外药敏试验,以便及时监测耐药株的出现,并选择合适的治疗药物。药敏试验方法存在的主要问题是不够规范,实验室间甚至室内都有较大差异,提倡多实验室之间的质控协作。自从酵母菌NCCLSM227 系列标准化的药敏试验方案引进国内后,加大了酵母菌的药敏试验规范化进程。2002 年丝状真菌M238 系列方案问世,为产孢丝状真菌提供了规范化的方法。经过初步验证,其稳定性和重复性较好,目前已成功应用于曲霉菌和镰刀菌等丝状真菌的体外药敏试验检测。此外,还有一些商品化的美国临床实验室标准化委员会(NCCLS) 方案的替代方法,如浓度梯度法( Etest) 等,其与液体培养基法比较一致,操作更为简便。缺点是对新近上市的作用于真菌细胞壁的药物尚无法测定。最近NCCLS 又公布了M442P 酵母菌纸片扩散法敏感试验方案,方法比较简便,可对氟康唑和沃尔康唑的体外药敏进行测定。另外,以菌体代谢水平为检测指标的体外药敏方法仍处于研究阶段,其准确性和可重复性尚未得到广泛验证。
从理论上看,这些方法应能更好地反映真菌在药物作用下的生长、代谢状况,对治疗的指导意义更大;而且具有快速、客观性强的特点,是抗真菌药敏的发展方向。目前临床菌株中不断筛选出耐药株,但其与临床疗效之间是否完全一致很少有人研究,实际这是一个非常重要的问题,究竟体外试验是否可以完全反映体内的情况? 如果不能,还有可能如何改进? 另外一个问题是联合用药,因为操作比较繁杂,目前国内这方面工作不多,如果能与临床疗效相结合起来进行观察,将更具说服力。
现代医学的发展向临床工作者不断提出了新的挑战,医学真菌的实验室检查是一项不断发展完善的技术,在从事这项工作中,应以形态学为基础,综合各项先进的技术检查结果作出正确判断,切实为真菌病的防治做出贡献。展望未来,随着新技术的日新月异发展,对致病真菌的特性研究将不断深入,对致病性真菌基因组序列分析将进一步促进真菌感染的流行病学及诊断治疗的临床研究,一些更加先进的高新技术的应用,如基因芯片技术等将给临床真菌学检验带来更加显著的进步。只要我们不懈地努力,坚持密切结合临床,扎扎实实做好常规检验并积极开创真菌检验新方法,临床真菌检验更加辉煌的明天就一定会到来.
