微生物检验—血清学试验
血清学试验是根据抗原与相应的抗体在适宜的条件下，能在体外发生特异性结合的原理，用已知抗体或抗原来检测未知抗原或抗体。因抗体主要存在于血清中，抗原或抗体检测时一般都要采用血清，故体外的抗原抗体反应亦称为血清学试验或血清学反应。血清学试验包括血清学鉴定和血清学诊断。血清学鉴定即用含已知特异性抗体的免疫血清(诊断血清)去检测患者标本中或培养物中的未知细菌或细菌抗原，以确定病原菌的种或型。血清学诊断是指用已知抗原检测病人血清中的相应抗体，以诊断感染性疾病的方法。血清学试验是临床微生物学检验的重要方法之一。血清学试验基本类型包括凝集反应、沉淀反应和补体结合反应等。
一、凝集反应
颗粒性抗原（细菌、红细胞、乳胶等）与相应抗体可发生特异性结合，在一定条件下（电解质、pH、温度、抗原抗体比例适合等）出现肉眼可见的凝集小块，称为凝集反应。参与反应的抗原称凝集原，抗体称为凝集素。凝集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应两大类。
(一)直接凝集反应
直接凝集反应指颗粒性抗原与相应抗体直接结合出现的凝集现象。
1. 玻片凝集试验
是一种定性试验。用己知抗体(诊断血清)测未知抗原，适用于细菌的鉴定或分群（型）等。方法是取已知抗体（诊断血清）滴加在载玻片上，直接从培养基上刮取待检菌混匀于诊断血清中，数分钟后，如出现细菌凝集成块或肉眼可见的颗粒，即为反应阳性。自临床初分离的细菌中，有些细菌表面含有某种表面抗原(如伤寒沙门菌的Vi抗原和志贺菌属的K抗原等)，这些抗原能阻止菌体抗原(O抗原)与相应抗体发生凝集反应，从而导致错误的判定。此时应将菌悬液于100℃中隔水煮沸(Vi抗原100℃30min
、 K抗原100℃ 1h)，待细菌表面抗原破坏后，再进行试验。
凝集试验简便、快速、特异性强，常用于沙门菌、志贺菌、致病性大肠埃希菌、霍乱弧菌、布氏杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌及链球菌等的鉴定。
2．试管凝集试验
为半定量试验。用等量抗原(细菌)悬液与一系列递倍稀释的抗血清混合，37℃保温4h后放室温或4℃冰箱过夜，观察结果。根据每管内抗原的凝集程度判定血清中抗体的相对含量。以血清最高稀释度仍有明显凝集现象者，为该血清中抗体的凝集效价，以表示血清中抗体的相对含量。
本法常用于测定免疫血清的效价、抗原的凝集性能；在临床上主要用于检测受试者血清中有无某种特异性抗体及其相对含量。如诊断伤寒、副伤寒的肥达反应、诊断布氏杆菌病的瑞特反应等。
(二)间接凝集反应
是将可溶性抗原或抗体吸附于某种与免疫无关一定大小的颗粒载体表面，制成致敏载体，再与相应抗体或抗原作用，在电解质存在的适宜条件下，被动地使致敏载体凝集，称为间接（或被动）凝集反应。
可用红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭等颗粒作载体，分别称间接血凝、间接乳凝、间接炭凝试验。由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上的抗原与少量抗体结合后，就能出现肉眼可见的反应，故可提高反应的敏感性。常用间接凝集反应来测定待检血清中细菌、病毒、螺旋体、寄生虫等抗原及自身抗体。间接凝集反应又可分为如下3种。
正向间接凝集试验
即将已知可溶性抗原吸附于载体颗粒上，然后与相应抗体结合产生颗粒凝集现象，用以检测未知抗体。
反向间接凝集试验
是将已知抗体吸附于载体颗粒表面，以检测相应可溶性抗原的凝集反应。适用于可溶性和颗粒性抗原的检出，如反向间接血凝试验检测乙型肝炎表面抗原及甲胎蛋白，协助诊断乙型肝炎和原发性肝癌。从食品中检出肉毒毒素和葡萄球菌肠毒素等。 检验地带网
间接凝集抑制试验
是将已知抗体或可溶性抗原先与被测的抗原或抗体混合，然后加入有关抗原或抗体致敏的载体颗粒，如已知抗体或可溶性抗原与被测的抗原或抗体相结合，则不出现颗粒凝集现象。故也可称为正向间接凝集抑制试验或反向间接凝集抑制试验。
协同凝集试验
协同凝集反应属于间接凝集反应的一种类型。它所用的载体是含SPA（葡萄球菌A蛋白）金黄色葡萄球菌。
SPA能与人及多种哺乳动物血清中IgG类抗体的Fc段结合，IgG的Fc段与SPA结合后，IgG的两个Fab
段暴露于葡萄球菌菌体的表面，并仍保持正常的抗体活性，当结合于葡萄球菌表面的已知抗体与相应细菌、病毒或毒素抗原接触时，则出现肉眼可见的凝集现象。方法简便、快速、敏感性高，易于观察结果，已广泛用于细菌的快速鉴定和分群（型），如脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、布鲁氏菌、沙
门菌及志贺菌等细菌。
二、沉淀反应
可溶性抗原(如细菌的培养滤液、含细菌的患者血清、脑脊液及组织浸出液等)与相应抗体相混合，在比例适合和适量电解质的存在等条件下，形成肉眼可见的沉淀物，称沉淀反应。利用沉淀反应进行血清学试验的方法称为沉淀试验。沉淀反应有环状、絮状和琼脂扩散法3种基本类型。
1．环状沉淀试验
将已知的抗血清加于内径1~3mm，长75mm的玻璃细管中约三分之一高度，然后沿管壁徐徐加入已适当稀释的待测抗原溶液，使成为分界清晰的二层，置室温或35℃5~30min后，如在两液面交界处形成肉眼可见的白色环状沉淀物为阳性反应。本试验主要用于鉴定微量抗原，如链球菌、肺炎链球菌、鼠疫耶尔森菌的鉴定及炭疽的诊断（Ascoli氏试验）。
絮状沉淀试验
指可溶性抗原与抗体在试管内以适当比例混合后，在电解质存在的条件下，出现絮状的沉淀物。有2种方法：一种是将恒定量的抗体分别与一系列稀释的抗原溶液在试管内混合，另一种是将恒定量的抗原分别与一系列稀释的抗血清在试管内混合，随后观察各管沉淀物出现的时间和量。通常在抗原与抗体比例最适管，出现沉淀物最快，量最多。本试验常用于毒素、类毒素、抗毒素的定量测定，还用于已知抗原测血清中的相应抗体，如肥达氏试验用于诊断伤寒、副伤寒等。
琼脂扩散试验
用琼脂制成固体的凝胶，使抗原和抗体在凝胶中扩散，若两者比例适当，则在相遇处形成肉眼可见的沉淀物（线或环），为阳性反应。常用的试验方法有：
(1)单向琼脂扩散试验：是将抗体预先在琼脂中混匀，制成凝胶板，凝固后在琼脂上打孔，孔中加入待试抗原，经一定时间扩散后，若抗原与抗体对应，则在孔周围比例适当处形成白色沉淀环。由于沉淀环大小与直径孔中抗原浓度成正比关系，故可事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，来测定未知标本中抗原含量。本法是一种定量试验，主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量。
(2)双向琼脂扩散试验：先制备琼脂凝胶板，待凝固后，根据需要在其上面多少个孔，孔间保持一定距离，然后将抗原和抗体分别注入小孔中，使两者相互扩散。如抗原与抗体相对应，浓度比例适当，经一定时间扩散后，在抗原抗体孔之间出现清晰的白色沉淀线。一对相应的抗原抗体只能形成一条线。因此，根据沉淀线的数目即可推测抗原液中有多少种抗原成分，根据沉淀线融合与否及交叉关系，还可鉴定两种抗原是否完全相同，还是部分相同。本法可用于检测未知抗原或抗体、分析和鉴定抗原成分、检测抗体或抗原的纯度、滴定抗血清的效价等。缺点是需时长，敏感性差。
(3)对流免疫电泳：是一种将双向扩散和电泳技术相结合的方法。试验时按双向扩散法在琼脂板上打孔，抗原加于阴极侧的孔中，抗体加于阳极侧的孔中，然后通电，在电场与电渗作用下抗原与抗体向相对方向移动，两者相遇后即可出现沉淀线。
(4)免疫电泳：是将琼脂电泳与双向琼脂扩散相结合的方法。先将抗原在琼脂平板上进行电泳，使其中各成分因电泳迁移率不同而分离区带。尔后沿电泳方向挖一与之平行的槽，加入特异性抗体作双向琼脂扩散。各区带中抗原分别在不同位置与抗体相遇生成弧状沉淀线。可据沉淀弧的数量、位置和形状，与已知标准抗原比对，即可分析样品中的成分及其性质。免疫电泳主要用于血清蛋白的组分分析。亦用于抗原和抗体提纯物的纯度鉴定。
三、补体结合反应
是一种在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素为指示系统的抗原抗体反应。在试验时，先将定量补体（使用新鲜的豚鼠血清）加入待检系统中，使抗原抗体优先结合补体。如果待检系统中抗原与抗体相对应，加入的补体可被抗原抗体复合物所结合而固定，不再与以后加入的溶血系统起反应，不出现溶血现象，为补体结合反应阳性。如待检系统中的抗原抗体不相对应，则游离的补体与后面加入的溶血系统反应，从而出现溶血，为补体结合反应阴性。如果待检系统中抗原抗体比例不适当时，仍有部分补体游离，则此剩余的游离补体可作用于溶血系统产生不同程度的溶血现象，据此可判断阳性反应的强弱，推知抗原或抗体的效价。
本反应可用已知抗原测定未知抗体，也可用已知抗体测未知抗原。多用于检测某些病毒、立克次体和螺旋体病病人血清中的抗体。亦用于某些病毒分型试验。
四、荚膜肿胀试验
1．原理
特异性抗血清与相应细菌的荚膜抗原特异性结合形成复合物时，可使细菌荚膜显著增大出现肿胀。
2．方法
取洁净载玻片一张，两侧各加待检菌1~2接种环，于一侧加抗血清，另一侧加正常兔血清各1~2接种环，混匀；再于两侧各加1％亚甲蓝(美蓝)水溶液1接种环，混匀，分别加盖玻片，置湿盒中室温放置5~10min后镜检。
3.结果
若试验侧在蓝色细菌周围可见厚薄不等、边界清晰的无色环状物而对照侧无此现象，为荚膜肿胀试验阳性；试验侧与对照侧均不产生无色环状物则为荚膜肿胀试验阴性。
4.应用
常用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和炭疽芽胞梭菌等检测。
五、制动试验
原理
特异性抗鞭毛血清与相应运动活泼的细菌悬液混合，则抗鞭毛抗体与鞭毛抗原结合，使鞭毛强直、相互粘着而失去动力，细菌运动停止。
方法
将待检标本或增菌培养液1滴置于洁净玻片上，用显微镜观察细菌运动情况。再于待检标本上加 l滴适当稀释的特异的抗鞭毛血清，混匀，作悬滴镜检。
结果
若滴加抗血清后3~5min内，细菌运动停止，菌体凝集成块为制动试验阳性；反之，滴加抗血清后，细菌运动无改变为制动试验阴性。
应用：主要用于霍乱弧菌的快速鉴定。
