轻松实现液相色谱的方法转换（二）
然后将方法转换到填充1.7μm填料的内径为2.1mm 的BEH C18 柱上。为了保持两个柱子上的线速度相同，将流速减小到0.22 ml/min，同时将进样量从2μl减少到0.8μl，压力为380bar。为了补偿延迟体积的差异，在梯度中引入了0.5min的初始持续时间。这些条件下的结果与用3.5μm 填料色谱柱非常相似（图1B），但得到结果（图1A）的速度稍快。
使用1290 Infinity LC设置，柱效和分离度明显提高。理论塔板数可以用柱长与2倍粒径之比进行粗略计算。因此，1.7μm 填料柱的柱效应为3.5μm 柱的两倍。由于分离度与柱效的平方根成正比，所以，在同一系统上分离度应提高1.4 倍。在这个特例中，分离度的提高比理论预计高得多（例如峰1和峰2的分离度从2.6提高到5.9）。这归功于Agilent 1290 Infinity LC系统更低的死体积和更卓越的泵驱动。
1290 Infinity LC系统提高分析速度
在1.7μm粒度色谱柱进行分析时压力是380 bar，远远低于1290 Infinity LC系统泵的1200 bar的压力上限。因此，还可以通过增大流速来缩短分析时间。当增大流速时，为了保持相同的洗脱曲线，应按流速的增加比例缩短梯度时间。
当流速从0.22ml/min加快到0.66 ml/min时，操作压力从380 bar增加到了1020 bar。正如预期的一样，色谱柱在非常高的压力或高流动相线速度条件下，产生了摩擦热。由于分析物中某些组分的保留与温度有关，所以我们注意到，在高流速下色谱柱的选择性有所不同。可以看出，主成分和化合物5之间、化合物7 和8的分离度尤其受温度变化的影响（图2A）。
将柱温从37℃降低到32℃，可以抵消热效应（图2B）。在该条件下，在4.5~5min内就可实现良好分离，与原来的LC相比，时间缩短了3 倍。然而当压力增加到1070 bar时，所用色谱柱却只能耐受1000 bar 的压力。色谱柱在比最大耐受压力更高的压力下使用更长时间后，柱寿命和方法的耐用性会明显降低。
因此，对于常规应用，若柱长从150 mm减少到100 mm，在0.66 ml/min 流速下形成的最大反压为880 bar。进一步缩短梯度持续时间和梯度时间来保持原方法的选择性。该方法总分析时间是3.5min，而原来用3.5μm 粒度色谱柱时总分析时间为15.5min（图3）。初始峰的分离度是3.8，这仍比用1200 系列LC系统得到的数值高。
方法验证
采用图3的条件，测定了线性、进样重现性和检测限（表4）等参数。得到良好的线性（所有化合物均大于0.999）和进样精度。RSD 在0.005% 左右，接近检测限（LOD）的某些化合物的RSD 均低于8%，大多数化合物的RSD 低于3.5%。这都在该浓度水平的合格限内。在LOD 分析的色谱图见图4。LOD 相对于主要化合物（柱上50–250 pg）， 在0.001% w/w 到0.005% w/w 之间波动。这说明，杂质水平低于报告阈值10 到50 倍时仍可被检测到。
结论
本应用报告证明了将现有HPLC方法转换为Agilent 1290 Infinity LC系统方法的可行性。开始，我们将在1200 系列LC上建立的HPLC 分析方法简单移植至1290 Infinity LC系统上。如果考虑了某些仪器特征，该方法转移将相对简单。然后把原来的色谱柱（150 mm × 3.0mm，3.5μm 粒度）换成粒度更小的（1.7μm）窄内径（2.1mm）柱。此转换使化合物之间的分离度显著增加。使用小于2 μm 填料的色谱柱可以通过提高流动相的线速度缩短分析时间，而且不会影响分离度。在高压和高流动相流速条件下产生的摩擦热改变了方法的选择性。为了维持原来的选择性，将色谱柱温度的设置降低。
最终的Agilent 1290 Infinity LC系统分析是在100mm柱上进行的，压力为880 bar，比原来的HPLC 方法快4倍。该Agilent 1290 Infinity LC系统方法已得到成功验证。检测限随着相当于柱上50~250 pg 的主化合物在0.001%w/w 到0.005%w/w 之间变化，这比要求的报告浓度水平低10~50倍。
