用于小鼠诱导多能干细胞的逆转录病毒的制备及感染

2019.4.17

实验概要

主要试剂

0.05%Trypsin、Polybrene、细胞基础培养液、DPBS、冻存液、Lipo LTX、Opti-MEM、Plat-E培养液、0.1%明胶

主要设备

35 mm、60 mm、100 mm培养皿；1.5 mL、15 mL、50 mL离心管；0.45 µm滤器、超滤管

实验材料

Plat-E细胞：Plat-E是非常重要的逆转录病毒包装细胞系（Ecotropic），全称是Platinum-E，来源于人胚肾(Human Embryonic Kidney, HEK)293细胞系。主要用于快速、短暂地产生高滴度逆转录病毒，同时也能用于稳定地产生逆转录病毒。由Plat-E包装细胞系产生的病毒表达一种单嗜性的被膜，只能感染小鼠和大鼠细胞，因而安全性较高。
质粒：pMX-SOX2、pMX-OCT4、pMX-KLF4、pMX-C-MYC和pMX-GFP。这些质粒来源于addgene公司，质粒的详细信息可从公司网站获得。质粒扩增和提取的具体原理和步骤可见《分子克隆实验指南》。
MEF细胞：MEF的原代培养、传代、冻存及复苏

实验步骤

（1）Plat-E细胞的培养
①在1个100 mm培养皿上铺3 mL0.1%的明胶。
！注意：Plat-E细胞贴壁效果较差，需要用明胶铺皿。
② 0.5～1 h后，准备复苏Plat-E细胞，事先在15 mL离心管中加入5 mL的复苏液（即细胞基础培养液）。
③从液氮罐中取出1管Plat-E细胞，放到37℃水浴中迅速融化,将细胞逐滴加到事先准备好的复苏液中，室温1000 r/min离心5 min。
④弃上清，将离心下来的细胞用Plat-E细胞培养液重悬，接种到吸弃明胶的100 mm培养皿上。
！注意：明胶需要铺30 min以上，以保证Plat-E的贴壁效果，吸弃明胶之后需要用DPBS冲洗一遍培养皿。
⑤细胞接种后2天，当Plat-E细胞融合度达到90%之后，将细胞以1∶4的比例传代：首先吸弃培养液，DPBS轻轻洗一遍细胞；加入0.05%Trypsin消化1 min，用细胞基础培养液终止消化；将细胞悬液转移到15 mL离心管中，室温1000 r/min离心5 min；吸弃上清，将离心下来的细胞用Plat-E培养液重悬，然后接种到新的铺有明胶的培养皿中。
！注意：由于Plat-E细胞贴壁不牢，DPBS冲洗的时候不要太用力。
（2）逆转录病毒包装
①当Plat-E细胞长满培养皿之后，将细胞用0.05%Trypsin消化1 min，用细胞基础培养液终止Trypsin消化，将细胞悬液转移到15 mL离心管中，室温1000 r/min离心5 min，弃上清，用Plat-E培养液重悬细胞，用细胞计数板计数，将细胞接种到5个铺有0.1%明胶的100 mm培养皿上，每个培养皿上细胞接种的量是3×10⁶。
②24 h后，为Plat-E细胞换液：弃掉旧的培养液，在每个100 mm培养皿中加入5 mL的Opti-MEM。
③用LIPO LTX& Plus Reagent进行转染：准备5个灭菌的1.5 mL离心管，在每个管中加入1 mL的Opti-MEM培养液；分别加入8 μg质粒（pMX-SOX2、pMX-OCT4、pMX-KLF4、pMX-C-MYC和pMX-GFP），用1 mL移液枪吹打混匀；在每个离心管中加入8μL的Plus，用1 mL移液枪吹打混匀，并在室温中静置5 min；在每个离心管中加入20 μL的Lipo LTX，轻轻混匀，室温静置30 min。将以上制备的1 mL的转染试剂分别加到准备好的Plat-E细胞中，并前后振荡混匀。然后将细胞放入培养箱中培养。
！注意：涉及到病毒操作的实验应该在生物安全柜中操作，并且对于废弃的细胞和废液应该做消毒处理。
④12 h后，为转染后的Plat-E细胞换液：弃去旧的培养液，尽可能吸净，然后在每个培养皿中加入6 mL的不含SP的细胞基础培养液。
⑤收集病毒：36 h后，收集各个培养皿的培养液，并向各个皿中补加6 mL不含SP的细胞基础培养液，将收集的培养液分别用0.45μm滤器过滤，过滤后的培养液直接用于感染或者用超滤管浓缩后放置在-80℃冰箱备用。36 h后再次收集病毒，用同样的方式处理。
！注意：由于病毒浓缩和冻存会造成病毒的损失，从而降低病毒的滴度，因此，为保证病毒的感染效率尽可能使用新鲜的病毒。
（3）逆转录病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞
①MEF细胞传代（具体方法参见P35），细胞密度为1×10⁵ cells/ 35 mm培养皿。
！注意：感染时细胞的密度至关重要，密度太低病毒感染会引起细胞死亡，密度太高病毒的感染效率下降。
②24 h后，将以上收集的4因子病毒等量混合，并轻轻混匀。
③将Polybrene溶液加入病毒溶液中，使其终浓度为4 μg/mL，并轻轻混匀。
④弃去MEF的培养液，然后将病毒液加入MEF细胞中，每个35 mm培养皿加2 mL的病毒液，记为Day 0。
⑤24 h后吸弃掉旧的细胞培养液，加入获得的第2次收集的病毒液，记为Day 1。
⑥12 h后吸弃掉旧的细胞培养液，用细胞基础培养液为细胞换液。
！注意：二次感染时间不宜过长,一般不超过12 h，时间过长对细胞的毒性较大。