流式细胞分析分选术-2
第七章 流式细胞分析分选术
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转染24 小时后，一旦观察到经RIP 转染的细胞明显死亡，即可收获细胞。
每板分别收集培养液，在每个6cm 板中加入1ml 胰酶(细胞消化的方法同上)，
消化完毕，加入已收集的培养液(注意一一对应，防止弄错)中和胰酶，离心(300g，
5min)收集细胞。
3.4 上机样本制备
收集细胞液(包括上清) 同时准备56℃水浴处理细胞
分别取一点
没有转染的细胞
作为control
及转染的细胞
作为GFP 单染样本 PBS 洗
染AnnexinV Ab-PE 染7-AAD
室温避光15min
PE-mouse IgG 室温避光染色15min
1╳binding buffer 洗两次
染7-AAD，室温避光15min AnnexinV Ab-PE/ 7-AAD 染色，室温避光15min
3.5 上机
在cellquest 环境下，选择FL-1(GFP)，FL-2(PE)及FL-3(7-AAD)作为研究对
象，先上control 样本标定电压，域值，再用单染GFP 的细胞样本及水浴处理后
单染PE,7-AAD 的样本，调节补偿，最终确立上样条件，进而上其他样本。
注：A:用GFP 单染样本以及水浴处理的单标Annexin V-PE 样本调节FL1-H 及
FL2-H 的补偿；
B:水浴处理的单标Annexin V-PE 以及水浴处理的单标7-AAD 样本调节
FL2-H 及FL3-H 的补偿。
4. CD69 检测
第七章 流式细胞分析分选术
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(或其他类似的免疫荧光检测)
4.1 细胞培养
1)细胞株及材料：
细胞株：Jurkat-T 细胞或Jurkat 细胞
培养基：RPMI 1640(10%FBS GBICO；1%双抗)，RPMI 1640(无血清)
培养器皿：75cm2 培养瓶;175cm2 培养瓶;25 cm2 培养瓶;96 孔细胞培养板
2)Jurkat-T 细胞的培养：
Jurkat-T 细胞为悬浮细胞，细胞活力好时，镜检多为10 个左右细胞聚团，
及少量游离的单个细胞，细胞圆而透亮。一般培养按密度来计算，起始培养
密度不要低于1×105 个/ml，24hr 后细胞密度即可达到2×105 个/ml，以此类推
在第五天上即可以达到1.6×106 个/ml，根据这个来调整接种密度及传代天数。
最好细胞的密度高不能超过1.6×106 个/ml。
例如，起始培养密度2×105 个/ml，体积30 ml，在第三天时, 细胞密度
达到8×105 个/ml，细胞总数达到2.4×107 个，因为检测一个待检基因的电击
所需细胞数量为1×107 个，所以，此培养的细胞数只能做2.4 个样品，因此，
根据实验所需要检测的样品数目来调整培养细胞的体积(象175cm2 的培养瓶
可以培养200-300ml 细胞悬液，细胞总数可以达到16-24×107，这样就可以做
16-24 个样品)。
4.2 电击转化
细胞总数达到检测样品所需则可转染(细胞密度最好在1×106/ml 左右)。
转染用品：电击仪，400mm 电击杯
质粒： a:对照质粒：NFAT 刺激系统：negative control:pEF-BOS
positive control: SYC plasmid
NFAT 抑制系统: negative control:pEF-BOS
positive control: SLIM plasmid
b: NFAT-luc report plasmid
c:目的基因质粒，构建在pEF-FN 载体上
试剂： 台盼蓝(0.4%)
1)将Jurkat-T 细胞转到50ml 离心管中，细胞计数(细胞密度最好在1×106 左右)。
第七章 流式细胞分析分选术
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2)1000rpm离心，用无血清的RPMI1640 培养液收集细胞，调整浓度为2.5×107/mL,
每个电极杯中加入400μl 细胞液(细胞总数为1×107 个)。
3)依次加入10μg NFAT-luc reporter gene 和20ug interest gene(体积控制在20μl 以
内)，使质粒和细胞混匀(尽量不要产生气泡)。
4)电击条件250V，950μF。电击前轻轻弹击电击杯，将杯底的细胞重悬起来，注
意不要产生气泡。电击时观察一下time constant(约为24ms)。
5)电击完后立即弹击电击杯的侧壁使细胞混匀，室温下放置30min。
6)将电极杯中的细胞加到10mL RPMI1640 培养液中(含serum)24cm2 培养瓶，培
养40hr(即培养到第三天上午)。
4.3 铺板，加药
C305：1∶60 稀释使用
PMA: 储存浓度为0.5mg/ml，应用浓度为50ng/ml(稀释10000 倍))
Ionomycin: 储存浓度为1mM，应用浓度为1μM(稀释1000 倍))；
1)将转染培养40hr 后的细胞转到15ml 离心管中，进行活细胞计数(台盼蓝染色)，
离心收细胞，调整细胞浓度为2×106/ml。
2)在96 孔板中，每孔加50μL 细胞(细胞数为1×105)，每个样品还是要做3 个复
孔。NFAT 刺激系统，NFAT 抑制系统可以同时进行，前者无需加药刺激，后
者需要做C305 抗体刺激和PMA+ Ionomycin 刺激，因此，一个样品需要做9
个复孔。按顺序在96 孔板中加入细胞，并相应做好标记。
3) 对于NFAT 刺激系统，直接在每孔中补加50μl 新鲜培养基，使终体积为100μl；
对于NFAT 抑制系统分别加入50μL C305(anti-TCR, 60 倍稀释)；或50μl
PMA(50ng/mL)+Ionomycin(1μM)，刺激8-12 小时。
4.4 细胞收获及处理
将刺激8-12 小时后的细胞取出，离心收集细胞
4.5 样本制备
第七章 流式细胞分析分选术
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A:CD69 间标法
Cells harvested
1 × PBS 清洗两遍
Cells were suspended in 1ml 1×binding buffer (1% BSA)
(cell 浓度约1×106/ml)
取其中的100μl
5μl pure-Mouse IgG1 5μl Mouse anti-human CD69 (或其它一抗)
(非特异性染色)
4oC 或冰上放置， 30min
1×binding buffer (1% BSA) 清洗两遍(每次4ml)
5μl PE goat anti-mouse IgG 及 5μl 7-AAD
4oC 或冰上，避光放置15min
1×PBS 清洗两遍(每次2ml)
上机
B:CD69 检测直标法
操作步骤基本同间标法，只是作非特意性对照的样本，直接用Mouse
anti-human IgG-pe 直接标记
4.6 上机
第七章 流式细胞分析分选术
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在cellquest 环境下，选择FL-1(GFP)，FL-2(PE)及FL-3(7-AAD)作为研究对
象，先上control 样本标定电压，阈值，并调节补偿，最终确立上样条件，进而
上其他样本。
4.7 几种药物的储存浓度和应用浓度
TNF 1×106U/瓶 1mg=4×107U, 1×106U=25μg 溶于12.5mL PBS 中，浓度为
2μg/mL。
储存浓度：2μg/mL
应用浓度：20ng/mL(稀释100 倍)
C305 60 倍稀释使用。
PMA and Ionomycin(dissolved in DMSO)
PMA:1 支1mg 溶于2ml DMSO 即0.5mg/mL(储存于-80°C)
储存浓度：0.5mg/ml
应用浓度：50ng/ml(稀释10000 倍)
Ionomycin: 1mg/747.1(MW)=1.33×10-3mmol 溶于1.33ml,浓度为1mM。(储存与
-80°C)
储存浓度：1mM
应用浓度：1μM(稀释1000 倍)
5. 细胞分选
5.1 分选细胞样本处理
第七章 流式细胞分析分选术
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贴壁细胞培养：一个细胞样本 悬浮细胞培养：一个细胞样本
至少需要一个10cm 细胞板 细胞总数应大于1×107
(细胞总数大于1×107 )
收集细胞
去除培养液
胰酶消化(一般加入2ml 胰酶，
37 oC 充分消化，大约3 分钟,
消化至细胞轻拍脱壁)
加入5ml 培养液中和，充分
分散细胞(尽量使之呈单
细胞悬液,可通过显微镜观察判断)
取100ul 细胞上机，测定转染效率，剩余细胞记数，离心
根据转染效率，分选模式(一般选用exclusion 模式)，调节细胞浓度，达到
上样速率1000-3000 个/秒，目的细胞300 个/秒(细胞浓度(个/ul)=300/目的
细胞百分率)
上机，分选
分选后细胞，1500 转/秒，5min,离心收集细胞
1) 若所要分选的是悬浮细胞，要求细胞总数大于1×107，直接收集细胞液
2) 必需的control：举例说明，如果需要筛选的是GFP 阳性的细胞，必须提供没
有转染的同种细胞。
3) 如果分选后的细胞还需要继续培养，需要预先用无菌的4%BSA 包埋收集管
(在无菌收集管中，加满4%BSA ，并放置于4℃至少1 小时，使用前倒除包
