实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）实验流程（一）
一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)
不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-TimePCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
在总rna的提取过程中，注意避免mRNA的断裂;取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNaseI进行消化(因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂)。
二、DNAseI消化样品RNA中的DNA
用DNaseI消化DNA
组份加量
模板(RNA)10ug
RNaseInhibitor4ul
DNaseIbuffer10ul
DNaseI10ul
DEPC处理H2O至100ul
混匀，37℃90min
三、RNA琼脂糖凝胶电泳
1.1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：
1)称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml的DEPC水，放微波炉里溶化。
2)待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀(避免产生气泡)。倒入凝胶板上凝固30min。
2.取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。
3.120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。
4.RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。
实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）实验流程
四.RNA反转录为cDNA
反转录程序(以MBI的M-MLV为例)
组份加量(20ul体系)加量(40ul体系)
模板(RNA)0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整)3ug(根据条带的亮度适当调整)
引物T18(50uM)(或其他引物)2.0ul4.0ul
DEPC处理H2O至12.5ul至25ul
混匀，70℃5min，立即冰浴
5*buffer4.0ul8.0ul
dNTP(10mM)2.0ul4.0ul
RNaseInhibitor0.5ul1.0ul
混匀，37℃5min
M-MLV1.0ul2.0ul
42℃60min，70℃10min
反转录引物的选择与Real-TimePCR引物设计的要求
1)随机六聚体引物：
当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA*链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2)Oligo(dT)：
是一种仅对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。
3)特异性引物：
zui特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，*条链的合成可由与mRNA3’端zui靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
做RealTimePCR时，用于SYBRGreenI/EvaGreen法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：
①Tm=55-65℃
②GC=30-80%
③PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。
④引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，zui好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMEREXPRESS都应该可以的。做染料法zui关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不易。
