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琼脂糖凝胶电泳和蛋白质分离纯化

2020.7.28

  脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作为介质的一种电泳方法,其兼具“分子筛”和“电泳的双重作用。

  琼脂糖(Agarose)是一种线性多糖聚合物,是从红色海藻产物琼脂中提取而来的,当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质,其密度是由琼脂糖的浓度决定的。

  经过化学修饰的低熔点的琼脂糖,在结构上比较脆弱,因此在较低的温度下便会熔化,可用于核酸片段的电泳检测。

  琼脂糖凝胶电泳检测的主要是核酸的完整性和大小,只要核酸不是太小或者太大(超出电泳分离范围),该方法的可信度非常高。

  琼脂糖凝胶电泳的原理

  荧光染料检测核酸的存在

  观察琼脂凝胶中核酸的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭(EB)进行染色,所用的荧光染料含有一个可以嵌入核酸的堆积碱基之间的荧光基团,当染料与核酸结毛细管电泳(CE)合后呈现荧光。

  核酸吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料,被结合的染料本身在302nm和366nm有光吸收,这两种情况下,被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来,因此,当凝胶中含有游离的EB时即可以检测到DNA和RNA的存在。

  注1:由于EB具有很强的毒性,因此在操作时一定要戴手套,并且最好有专门的区域进行电泳检测实验。

  注2:可以使用GoldView染料代替EB,其具有相同的检测效果,同时毒性要低很多。

  电泳区分核酸大小

  核酸会根据pH不同带有不同电荷,在电场中受力大小不同,因此跑的速度不同,琼脂糖凝胶电泳即根据这个原理对核酸进行区分。

  核酸分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于核酸的戊糖-磷酸骨架在结构上具有毛细管电泳(CE)重复性,长度相同的核酸链几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

  此外,含有琼脂糖的凝胶具有网状结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在琼脂糖凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。

  在同样电场的强度下,核酸分子的迁移速度取决于核酸分子本身的大小和构型以及琼脂糖凝胶的浓度,简而言之,分子量较大的核酸迁移速度较慢,分子量较小的核酸迁移速度较快,这就是应用凝胶电泳技术分离核酸片段的基本原理。

  蛋白质是生物体的主要组成物质及生命活动的基础,蛋白分离和纯化是生物化学研究中的一项重要工作,蛋白分离公司可以选择适当的分离纯化程序来获得高纯度的蛋白质制品。毛细管电泳法是经典电泳技毛细管电泳(CE)术与现代微柱分离技术的完美结合,使分离科学进入纳升水平,常用于蛋白质的分离和纯化,具有高效、快速、微量、灵敏度高、实验经济、应用面广等特点。

  在外电场的作用下,带电颗粒向着与其所带净电荷相反的电极移动的现象成为电泳,电泳法是根据蛋白质的电荷不同分离蛋白质混合物的方法。蛋白质在电场中移动的速度和方向,取决于它所带电荷的性质、数目、分子质量大小和形状等,带电少、分子质量大的蛋白质泳动的速度慢。

  反之,泳动速度快,因此混合在一起的蛋白质按照各自的带电特点,移动不同的距离从而得以分离。电泳结束后,用蛋白质显色剂显色,毛细管电泳(CE)可以看到一条条被分离的蛋白质条带。毛细管电泳法是兼具电泳和色谱技术的双重优点,广泛包含在一些蛋白分离公司的服务中它是一类以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。

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