琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验原理和操作方法
实验原理
琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧光，因此可对分离的DNA进行检测。电泳时以溴酚蓝及二甲苯氰（蓝）作为双色电泳指示剂。其目的有：①增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内；②使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利；③以0.5×TBE做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长300bp的双链DNA相同，二甲苯氰（蓝）则与4bp的DNA相同。
线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系
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琼脂糖凝胶的百分浓度（%） |
分离线状DNA分子的有效范围（kb） |
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0.3 |
60~5 |
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0.6 |
20~1 |
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0.7 |
10~0.8 |
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0.9 |
7~0.5 |
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1.2 |
6~0.4 |
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1.5 |
4~0.2 |
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2.0 |
3~0.1 |
试剂和器材
一、试剂
5ⅹTBE溶液：54gTris，27.5g硼酸，4.6g EDTANa2溶于去离子水中，定容至1L。电泳时10倍稀释使用。
5ⅹ上样缓冲液：用5×TBE溶液配制0.5%溴酚蓝，再加等体积甘油混匀。
溴化乙锭溶液：5mg/ml的溴化乙锭，避光保存。
0.7%琼脂糖，用1×TBE溶液配制。
二、器材
电泳仪、水平电泳槽、紫外分析仪。
操 作方法
（1）琼脂糖溶液的制备：配0.7%琼脂糖，在沸水浴中煮沸直到完全溶解；将溶液冷却到约50~60℃，加入溴化乙锭到终浓度为0.5ug/ml。
（2）将琼脂糖溶液倒入电泳支架上，放上梳子，梳子须离开电泳支架底部1mm左右。待凝胶凝聚后，小心拔去梳子，将支架放入装有电极缓冲液的电泳槽中，电极缓冲液应淹没过胶。
（3）电泳
取薄膜，滴加上样缓冲液和DNA样品5~10ul，混匀，用微量移液器加入样品槽中。点样端朝负极，通电。电压为10v/cm。至溴酚蓝移到距边1cm处，取出凝胶，紫外灯下检测。
注意：
溴乙啶是一种强致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应进行如下处理：
方法I：（1）每100ml溶液中加非离子型多聚吸附剂Amberlite XAD-16.29g；
（2）室温下放置12小时，不时摇动；
（3）用新华1号滤纸过滤，弃滤液；
（4）用塑料袋封装滤纸和Amberlite树脂，作为有害废物丢弃。
方法Ⅱ：（1）每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭；
（2）室温条件下放置1小时，不时摇动；
（3）用新华1号滤纸过滤，弃滤液；
（4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物丢弃。
溴乙啶在260℃分解，在标准条件下进行焚化后不会有危险性；Amberlite XAD–16或活性炭可用于净化被EB污染的物体表面。
