蛋白质浓缩和溶质的去除实验（五）
五、冷 冻 干 燥
溶液中溶质的浓缩可以从热力学上通过驱使溶剂变成气态进人顶部空间 (蒸发) 或煮沸而实现。不幸的是，不稳定的溶质(如蛋白质分子)可以被用于除去溶剂所需的热量快速降解。由于溶液的沸点是溶液的蒸气压等于大气压 (顶部空气压力） 时的温度，因此，通过增加溶液的温度或通过降低大气压力 (如采用真空) 都可以使溶剂沸腾。其中后者被称为真空浓缩 ( v a c u u m concentration)。在冷冻干燥的过程中，样品的温度比溶液的凝固点要低 ，溶剂通过升华而被去除。冷冻和真空可同时进行，热量和顶部的空气此时被除去，从而对感兴趣的产品进行浓缩。将要被冷冻干燥的液态蛋白质产品通常含有生物活性成分 、溶剂体系和几种膨胀剂及稳定剂。膨胀剂为活性分子提供支撑结构，而稳定剂则在冷冻干燥之前和样品重新组成之后的液态形式下，对目标蛋白质活性的维持发挥重要的作用 。冷冻干燥一般分为 3 个主要的步骤 （Costantino and Pikal， 2004;Jennings, 1999;Przic et al.， 2004)
（1） 冷冻冷冻速率会影响最终产品的质量。例如，慢速冷冻会导致大冰晶的形成,它会加快冷冻干燥的速率，但可能会使不稳定的蛋白质变性。相反 ，当样品冷冻快速进行 ，会形成小的冰晶，它会使冷冻干燥速率降低，但却能保护蛋白质的稳定性。
(2) 初 级 干 燥 在 初 级 干 燥 过 程 中 ，通过升华作用, 大于 8 0 % 的溶剂从固态直接变为气态。残留的溶剂以湿气的形式仍然吸附在产品上。类似于冷冻速率，干燥速率会影响冻干「蛋糕」的结构和形态，所设计的速率要避免样品融化。
(3)
二 次 干 燥 在二次干燥中，溶
剂残留的吸附降低到足以抑制微生物生长或化学反应发生的潮湿水平，但同时仍保持了冻干产品的活性和完整性。产品的物理性质决定了二次干燥的可持续时间。例如，蛋白质通常需要残留水分的存在以维持结构的完整性和生物活性。必要残余水分的量因产品而异，必须凭经验而定。
图 9. 4 总结了冷冻干燥器的主要组成和操作过程。尽管冷冻干燥机的设计因操作规模的不同而有所差异，然而其主要部件和系统需求并没有改变。过去十年来的创新提高了所有的不同规模冷冻干燥装置的效率、成本效益、准确性和便利性。这些改进因计算机控制的自动化而被增强。特别是，自动化的样品装载/卸载系统通过最大限度地减少用户的手动操作使这一过程更加精确。增 强 型 实 时 过 程 控 制 和 监 测 的 应 用 ，如 S M A R TFreeze Dryer™ Temperature Monitoring 技术（SP Industries， Warminister， P A ) 允许在关键的冷冻干燥周期改善温度控制。例如 ，核磁共振技术 (N M R ) 通过无创的、无接触的重量检测技术取代了传统的称量技术。
尽管有这些改进，在冷冻干燥过程中固有的局限性依然存在。最困难的挑战之一是实现特定产品的目标含水量。当残留溶质-结合水在二次干燥过程中从产品中被去除时，过度干燥会导致产品稳定性降低。未来的冷冻干燥系统将结合精确的监控系统，使用改进的过程质量流量计技术，精确监控冷冻干燥循环中水分的移除。
与当前提高了性能的中试规模的和大型的冷冻干燥器相称的是，已发展的实验室规模系统可以处理相对小的样品体积。 S P Industries 公司、L a b c o n c o 公 司 和 Martin Christ公司专攻实验室规模系统的开发。新的台式系统为通过干冰进行冷冻干燥提供了简单而经济的设备。例如 ，特殊的系统配备一个中心井用于提供干冰和溶剂，它可以作为水蒸气收集器和方便的预冷棺。烧瓶、血清瓶和安 瓿 浸 入中心井并在里面旋转而被冻结。此外，紧凑的台式冷冻干燥机被设计为具有快速的干燥速率，它无限制的蒸汽通道、更高效的冷凝器以及具有阀门的多出入口复合管路等设计使得其工作效率达到最大。总体而言，当前及未来的实验室和商用的冷冻干燥器正被设计成包含有微型处理器控制的形式，以减少操作错误，最大限度地减少手动操作，提高整体系统的性能。
六、沉淀
沉淀是一种常用的纯化技术, 用于蛋白质的浓缩和脱盐。蛋白质沉淀是通过加入某种试剂来改变蛋白质的溶解度，从而将蛋白质从一种溶液中以固体的形式分离的过程。蛋白质沉淀问题将在第 2 0 章中详细讨论。沉淀操作通常成本低廉，易于放大。此外, 大部分沉淀往往在包含有 DNA、脂类和杂质蛋白质的初始料液中进行。有多种方法或系统可用于进行沉淀操作。该项操作的难点是如何确定可完成预期目标的最适方法。沉淀反应可以通过加人中性盐、有机溶剂、非离子型亲水聚合物、多价金属离子等来诱导，或通过加人酸或碱来进行等电点沉淀（Harrison etal. ， 2003)。影响蛋白质溶解度最重要的因素是结构、大小、电荷和溶剂 (Ladisch, 2007)。一旦蛋白质沉淀, 便可以将之通过随后的离心或过滤从溶液中分离。沉淀可以重新溶解到较小体积的溶液中从而达到蛋白质的浓缩 ，或经洗涤并重新溶解到新溶液中以改变溶液的条件。
有
许 多 市 售 的 滤 板 或 管 可 以 以 9 6 孔 板 的 形 式 使 用（A n a c h e m ， U K ;
MilHpore，Bedford, M A ; Pall, M e r i d e n, C T ),
它们的使用可以实现以最小量的资源来筛选沉淀条
件
。这些板也可以使沉淀技术自动化，进一步节省了资源。市售的结晶筛选试剂盒内含有能反映蛋白质潜在沉淀/结晶条件的即用型溶液，对探索宽范围的缓冲液、p
H 和沉淀剂也非常有用 （H a m p t o n Research, Aliso Viejo, C A ; Sig m
a-Aldrich, S t L o u i s ， M O
)。许多沉淀方法，包括使用有机溶剂的沉淀和等电点沉淀，可能会导致蛋白质变性或生物活性降低。虽然有损于蛋白质的功能，但这些沉淀方法通常还是被用于去除包含在生物制品溶液中的那些会干扰下游应用和分析的组分。一些分析技术通常采用变性的蛋白质
，不需要蛋白质具有生物学活性和其他功能。例 如 ，将蛋白质变性是 SD&
PAGE分析方法的一部分。对于这些应用，可将蛋白质变性的沉淀方法仍然适用 。 一 些常用的沉淀
剂用于样品分析前蛋白质的浓缩和干扰物的消除，包括乙醇、丙酮、氯仿/甲醇、TCA 等 。
使用丙酮进行蛋白质沉淀可以通过向蛋白质样品中加入
4 : 1 的冷丙酮（一 20°C )
来完成。然后进行混合、离心，并将上清液丢弃。这一过程可以重复以更好地去除盐类和其他杂质。随后将沉淀物干燥并重溶于目标缓冲液中。一个类似的操作是将
9 : 1 体积的冷乙醇 (-20°C) 加人到蛋白质样品中。使用乙醇的一个优点是它的易燃性小于丙酮。 Wessel和 Flugge
(1984)提出了一个氯仿-甲醇沉淀系统, 提高了对稀蛋白质溶液的回收率。TCA
沉淀法被认为是一种将蛋白质从稀溶液中沉淀的非常有效的方法。向蛋白质样品中加人同等体积的 2 0 % TCA，冰 浴 30 min。 4°C
离心，弃去上清液。然后将片状沉淀物用冰丙酮 (一 20°C) 洗涤，4°C 再次离心, 弃上清液，干燥。沉淀物可以用目标缓冲液溶解
。可能需要额外的丙酮洗涤或中和重新溶解的样品，以降低酸度，有利于进一步的分析
操作 。 Svaraman 等 (1997) 证 明 在 TC A 浓 度 为 1 5 % 左右时进行蛋白质沉淀效果最佳。
在许多情况下，实验者希望在沉淀操作后蛋白质的活性和结构仍可以保留。该目标可以通过向蛋白质样品中加入中性盐(盐析) 或亲水性非离子型聚合物 (如聚乙二醇) 来实现 。 Hofmeister (1887;1890) 首先描述了使用中性盐沉淀蛋白质的方法。最常用的盐是硫酸铵，因为它水溶性极高, 并对蛋白质的生物活性无有害作用。硫酸铵沉淀通常是通过缓慢地将饱和硫酸铵溶液 (41. 22 g/100 g 水 ,25 °C ) 加人到蛋白质样品中以达到所需要的浓度来完成。不同的蛋白质在硫酸铵中的溶解度有很大的差异，所以 ，通过预实验来确定目标蛋白质从溶液中沉淀时硫酸铵的浓度可能是非常有益的。蛋白质的这一特性使得将一种蛋白质从其他蛋白质和污染物中通过分步沉淀而进行纯化的设想成为可能。亲水聚合物, 如聚乙二醇 (PEG) 也可以用于沉淀蛋白质而同时保留蛋白质生物活性。使用相对分子质量大于 4000 的聚乙二醇更易于进行蛋白质的沉淀。 Atha 和 Ingham (1981) 论证了使用浓度为 3% 〜30% (w /V )的 PEG 4000 对几种蛋白质的沉淀情况。
七、结晶
结晶是另一种纯化技术，它类似于沉淀作用，可用于蛋白质的浓缩和脱盐。蛋白质结晶是一个强大的分离技术，因为它可同时浓缩、纯化和稳定蛋白质产品 (Etzel， 2006)。结晶是一种在水溶液中受控制的沉淀，主要 有 4 个变量可用来控制结晶的形态和回收: 蛋白质的浓度、沉淀剂的浓度、pH 及温度。结晶类似于沉淀，都是从溶液中形成固体颗粒; 但沉淀具有不确定的形态，呈现出小颗粒特征，而结晶是髙度有序的，通常呈现出较大的颗粒 。多孔板和小型化的高通量筛选系统正被开发，它们与自动化液体处理方法及新型的分析方法相结合，使得对纳升 (nanoliter) 级样品进行宽范围结晶条件的快速筛选成为可能 (Brown et a l,， 2003)。 此 外 ，微流体芯片的应用已被发展用于生物分子的结晶（Tera-genics, Watertown, M A)。 实际上，对一个蛋白质进行结晶比对其沉淀往往更加困难，为了进行蛋白质的浓缩和脱盐，沉淀往往是一种更常用的办法。此外，当结晶过程被从实验室水平放大时，混合的力度可显著影响晶体的稳固性。
