GFP(绿色荧光蛋白基因)的免疫印迹-2
第二部分：免疫印迹染色
[仪器、材料与试剂]
(一)仪器与器具
1．电泳仪(要求为大电流低电压)
2．电泳转移槽及转移夹
3．水平摇床
4．小塑料盒
5．镊子
6．搪瓷盘
(二)材料
1．醋酸纤维膜
2．滤纸
3．一次性塑料手套
(三)试剂
1．转移电泳缓冲液
25mmo1／L Tris，192mmo1／L 甘氨酸，20％甲醇，pH 8.3
6.05gTris + 28．83g Gly + 400mL甲醇，用dH20溶解并定容至2L
2．PBS贮存液(10xPBS)
0.2mo1／L 磷酸缓冲液，PH＝7.4，含8.7％ 的NaCl
3．PBS缓冲液：10xPBS贮存液用重蒸水10倍稀释
4．封闭液：PBS + 5％脱脂奶粉
5．漂洗液：PBS + 0.2％Triton X-100
6．丽春红染色液：4％三氯醋酸，1％丽春红
7．一抗：兔抗GFP血清，用PBS适稀释50-100倍
8．辣根过氧化物酶标记的蛋白A (HRP-pA)
9．DAB显色液：DAB 1mg，溶于5mL的50mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.4-7.6）中，然后加入50微升的0.5％的过氧化氢。显色液不稳定，要在临用前配制。
[实验操作] （接第一部分的实验操作8往下做）
1．将醋酸纤维素膜（AC膜）事先裁成比需要转移的凝胶块略大的小块。
2．在搪瓷盘中加入转移电泳缓冲液，将AC膜在转移电泳缓冲液中浸泡，使完全浸透。同时把两块海绵也在转移电泳缓冲液中浸透。
3．将转移夹打开，置搪瓷盘中，在有黑色标记的一半上放上一块已浸透了转移电泳缓冲液的海绵，把贴在滤纸上的凝胶块滤纸面向下放在海绵上，在转移电泳缓冲液中使
AC膜紧贴在凝胶上，切勿使AC膜与凝胶间留有气泡。再把一张滤纸浸透，小心地放在AC膜上，其上再放上另一块海绵。将转移夹合上，夹紧，做成“三明治”。
4．转移电泳槽中放入转移电泳缓冲液，将“三明治”夹放入，使凝胶块（即黑色的一面）朝向负极，AC膜朝向正极，切勿放错方向，否则蛋白将跑到溶液中，而不是转移到膜上。
5．接通电泳仪电源，使电流达到100-150mA，电泳转移过夜。
6．转移电泳完毕，将转移“三明治” 夹从转移电泳槽中取出，将夹子打开，用镊子捏住AC膜的一角，将AC膜有蛋白的一面朝上放在一块干净的滤纸上。于暗处在紫光灯下，仔细观察发绿色荧光的条带的位置，用铅笔点一些点子，标出它。
7．将AC膜蛋白面朝上置于小塑料盒中，加丽春红染液10-20mL，染色3分钟，用蒸馏水轻轻漂洗数次至背景红色消失。这时应该可以看到转移到膜上的蛋白条带。
8．倾去漂洗的蒸馏水，在小塑料盒中加入封闭液10mL，室温下于脱色摇床上缓慢振荡1小时。
9．倒出封闭液（弃去），用PBS洗一次，加PBS稀释的一抗溶液5mL，室温下缓慢振动3小时或过夜。
10．取出AC膜，用PBS 漂洗液洗3次，每次5分钟(手摇或脱色摇床上振荡)。
11．放入HRP标记的蛋白A溶液中，在室温下于脱色摇床上缓慢振动3小时或更长时间。
12．取出AC膜，用漂洗液洗涤，方法同10。
13．加入DAB显色液5mL，轻轻晃动，显色数分钟或更长的时间，直到黄褐色的条带清晰可见，加入蒸馏水漂洗几次，洗去显色液，终止反应。注意主要的显色条带是否与事先用铅笔标记的位置相重合。
14. 将AC膜夹在两张干滤纸中间，将水分略微吸干，然后扫描或拍照，记录实验结果
