蛋白质免疫印迹-悬浮细胞蛋白提取简介
1）所需器材：制冰机、标记笔、两套1.5ml EP管（最好高温高压处理）、两个大冰盒、长满细胞的培养瓶、10ml离心管、手套、移液枪、吸头（最好高温高压处理）、滤纸、保存于4℃冰箱的PBS（最好高温高压处理）、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一种蛋白酶抑制剂，剧毒）、离心机、烧杯、4×SDS凝胶上样缓冲液、二硫苏糖醇（DTT）、泡沫板。
2）操作步骤
a.制冰机制冰；
b.标记笔将2套EP管做好标记；
c.将两个大冰盒装上冰，标记笔做好标记的两套EP管置于一个大冰盒上,带上另一个大冰盒，取出长满细胞的培养瓶平放在大冰盒上；
d. 戴好手套，将培养瓶细胞悬液吸至10ml离心管，4℃、3000转离心10分钟，弃上清，加1ml保存于4℃冰箱的PBS重悬细胞，再转移细胞悬液至1.5mlEP管中，4℃、3000转离心10分钟，弃上清，滤纸尽可能吸干管口残留液体；
e. 取出保存于4℃冰箱的三去污裂解液、保存于-20℃冰箱的PMSF, 往培养瓶中滴加三去污裂解液（一般为47－141ul/50ml培养瓶）、再加入PMSF（二者比例为94：6），移液枪吹打混匀，冰上静置15-25分钟，以上步骤均需在冰上操作；
f.离心机预冷，将静置15-25分钟后的EP管4 ℃、10000转离心10分钟；
g.将烧杯用自来水洗净，倒入单蒸水，电炉上煮沸；
h.备好4×SDS凝胶上样缓冲液（存放在常温），取出保存于-20℃冰箱的DTT置于冰上，用移液枪将离心后的上清液定量吸至另一套EP管中（勿吸取下层沉淀物），按上清液：4×SDS：DTT=3：0.8:0.2滴加4×SDS及DTT，掌上离心，然后小心将EP管插入泡沫板，投入已煮沸的烧杯中煮6-8分钟（电炉功率不要调太大，以免管盖爆开）；
i. 将泡沫板用镊子夹出，置大冰盒中冷却10分钟，掌上离心，再放入-20℃冰箱保存备用。
注意：裂解液也可酌情选用单去污裂解液或细胞裂解液等。
