P1噬菌体介导的普遍性转导（generalized transduction）-2
3、第三天，当噬菌体充分增殖后，将平板表面的半固体培养基转移到无菌的三角瓶中，加入5－10ml LB液体培养基和几滴氯仿，剧烈振荡20秒后离心(3000rpm, 10分钟)，上清液即为P1 cml, clr100裂解液。
4、将上清液移到无菌试管中，加入几滴氯仿，再次剧烈振荡20秒，于4℃保存。
(二)P1 cml，clr100裂解液效价测定
1、第三天，将30℃培养过夜的供体菌用10ml LB培养液按1：5稀释，30℃继续培养3小时。
2、分别吸取0.2ml新鲜培养物加入10支干净无菌的试管中，编号。
3、将待测噬菌体裂解液用LB培养液按1：10进行梯度稀释。
4、从每个稀释液中吸取20ul分别加入含供体菌的试管中，混匀。
5、于每支试管中加入3ml预平衡在50℃的LB半固体培养基，迅速摇匀后倒在LB固体培养基上，固化后37℃培养过夜。每组十一皿，其中一皿不加噬菌体作为对照。
6、第四天，统计不同浓度噬菌体裂解液的噬菌斑数，记录结果。计算P1噬菌体的效价，即每毫升噬菌体原液中P1噬菌体的数目（表3－1）。
（三）转导
1、第三天傍晚，接种受体菌株（CSH1）于5ml LB液体培养基中，30℃培养过夜。
2、第四天，将过夜培养的受体菌用LB培养液按1：5稀释，37℃培养2－3小时。
3、在培养液中加无菌的CaCl2溶液（终浓度为5×10-3mol/L）。
4、取滴定度约为1010/ml左右的噬菌体裂解液，稀释100、10-1、10-2、10-3倍。
5、取噬菌体稀释液与受体菌各1ml，加入一干净无菌的试管中混合。作为对照，其中一组应只加裂解液不加受体菌。
6、37℃保温20分钟，取出后离心15分钟，3500rpm。弃去上清液，加入1ml无菌生理盐水重悬菌体。
7、取100ul转导液涂布于乳糖色氨酸基本培养基（2皿）和葡萄糖基本培养基（1皿），37℃培养。以未经噬菌体处理的受体菌作对照，各涂1皿。同时将对照菌作梯度稀释，取10-5及10-6的稀释液分别涂布在色氨酸葡萄糖基本培养基上进行活菌计数。
8、第六天，观察统计菌落生长情况，计算转导频率（表3－2）。
（四）共转导测定
1、第六天，取0.1ml滴定度为109－1010pfu的T6噬菌体裂解液涂布在LB完全固体培养上（2皿），室温下待裂解液吸干。
2、用灭菌牙签挑取100－200个在乳糖色氨酸基本培养基上长出的单菌落，点种在上述涂布T6噬菌体的培养基上，37℃培养。
3、第七天，计数长出的菌落（表3－3），计算共转导率。
五、实验结果
1、P1噬菌体的效价测定
表3－1 不同稀释平板上出现的噬菌斑数
| 裂解液稀释度 | 100 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 | 对照 |
| 第一组 | |||||||||||
| 第二组 | |||||||||||
| … | |||||||||||
| 平均数 | |||||||||||
| 噬菌斑数/ml |
2、色氨酸和乳糖发酵基因的转导频率
表3-2 不同培养基上转导子数量统计
| 培养基类型 | 转导标记 |
转导子 数目/板 |
转导子 数目/ml |
受体菌 数目/ml |
转导频率* |
| [-]加葡萄糖 | Trp | ||||
| [-]加乳糖+trp | 乳糖 | ||||
| [-]加葡萄糖+trp | 活菌计数 |
3、计算乳糖发酵基因和T6抗性基因的共转导频率，并计算乳糖发酵基因和T6抗性基因的图距。
表3－3 共转导选择测定结果
| 组别 |
点种菌落数 (a) |
[+]+T6培养皿上 长出的菌落数(b) |
共转导频率* (X) |
| 一 | |||
| 二 | |||
| 三 | |||
| … | |||
| 平均数 |
*共转导频率X=(b&pide;a)×100%
d=L(1-X1/3)
