常用免疫组织化学染色方法 2
五)免疫组化双染色法。(ⅰ) (Ionmuno- Histochemistry double staimimg method)
1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入非免疫性动物血清，孵育 10分钟。
7.PBS洗3次，每次2分钟。
8.加入第一抗体孵育60分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10. 加入生物素化的第二抗体，孵育10分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.加入链卵蛋白素过氧化物酶孵育10分钟。
13.PBS 洗3次，每次2分钟。
14.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟。
15.PBS洗3 次，每次2分钟。
16. 加入双染增强液，孵育10分钟。
17. 加入非免疫性动物血清孵育10分钟。
18. PBS 洗3次，每次2分钟。
19. 加入选用的第二种抗体孵育60分钟。
20. PBS洗3次，每次2分钟。
21. 加入生物素标记的第二抗体孵育10分钟。
22. PBS洗3次，每次2 分钟。
23. 加入链卵蛋白素碱性磷酸酶孵育10分钟。
24. PBS洗3次，每次2分钟。
25. 加入AEC溶液，孵育5-10分钟。
26. 自来水洗。
27. 苏木素染核5-10分钟。
28. 水性封片。
注：1. 第一种复合物也可先用链卵蛋白素碱性磷酸酶。
2.第1次显色也可用BCIP/NBT溶液，颜色为蓝黑色，但应与苏木素鉴别。
(六)、免疫组化的双染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method)
1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2 甲醇处理切片10分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入选用的第一抗体孵育 30-60分钟。
7.PBS洗3次，每次2分钟。
8.加入增强剂孵育20-30分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10. 加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟
13.PBS洗3次，每次2分钟。
14.加入选用的第二种抗体孵育60分钟。
15.PBS洗3次，每次2分钟。
16. 加入增强剂孵育20-30分钟。
17. PBS洗3次，每次2分钟。
18. 加入酶标抗兔/鼠碱性磷酸酶复合物孵育20-30分钟。
19.PBS洗3次，每次2分钟。
20.加入AEC溶液孵育5-10分钟。
21.自来水洗。
22.苏木素染核5-10分钟。
23.水性封片。
(七)细胞培养片免疫荧光染色法。
1.将细胞于载片或盖玻片的片子用生理盐水洗几次。
2.纯丙酮固定10分钟。
3.PBS 浸洗3次，每次1分钟。
4.加入选用的第一抗体孵育120分钟。
5.PBS洗3次，每次2分钟。
6.加入荧光抗体孵育60 分钟以上。
7.PBS法3次，每次2分钟。
8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。
9.水洗，蒸馏水洗。
10. 水性胶封片或用缓冲甘油封片。
(八)真空负压免疫荧光染色法染细胞培养片。
1. 将细胞爬于载玻片或盖玻片的片子用生理盐水浸洗数次，彻底洗去蛋白液。
2.纯丙酮固定5-10分钟。
3.PBS 浸洗3次，每次1分钟。
4.加入选用的第一抗体孵育真空负压处理15分钟。
5.PBS洗3次，每次2分钟。
6.加入荧光抗体孵育真空负压处理15分钟。
7.PBS洗3次，每次2分钟。
8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。
9.水洗，蒸馏水洗。
10. 水性胶封片或用缓冲甘油封片。
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